1 Logique moléculaire du monde vivant
télécharger 30.64 Kb.
|
| MOLECULES Plan : 1) Logique moléculaire du monde vivant - importance de l’approche moléculaire - définition des systèmes biologiques - notions fondamentales 2) Notions de base - énergie - atomes et liaisons interatomiques - structure de l’eau, ionisation des biomolécules 3) Glucides et lipides 4) Protéines - acides aminés - liaison peptidique - différents niveaux de structure des protéines - méthodes d’étude des protéines 5) Introduction à la génétique moléculaire - Nature moléculaire du support du matériel génétique - réplication du matériel génétique - utilisation du matériel génétique ( ADN protéines code génétique, transcription, traduction) 6) Introduction aux manipulations expérimentales de l’ADN I) Logique moléculaire du monde vivant 1) Importance de l’approche moléculaire Pauling : « les êtres vivants obéissent aux lois de la physique et de la chimie » On ne décrit pas le vivant mais on comprend les mécanismes de fonctionnement des systèmes biologiques au niveau moléculaire. Ceci a différents débouchés : - les antibiotiques bloquant la prolifération des bactéries en détruisant les molécules produites par ces bactéries (ceux-ci ont permis une explosion de l’espérance de vie). - les antiviraux : bloquent la synthèse de protéines virales - chimiothérapie anticancéreuse - anti arythmiques, vasodilatateurs (β bloquants) - neuroleptiques Les enjeux économiques sont aussi importants : - industrie pharmaceutique (médicaments, tests, réactifs) - industrie agro alimentaire (pesticides, antibiotiques, plantes transgéniques) Ils posent des problèmes d’ordre éthique (intérêt financier, dépistage et manipulation génétique) 2) Définition des systèmes biologiques Un être vivant est un système possédant 3 caractéristiques à la fois :
Une structure a une organisation morphologique, moléculaire et des paramètres physico chimiques. Dans les systèmes bilogiques il existe de nombreuses boucles de rétroaction permettant de maintenir un organisme stable Exemple du glucose et de l’insuline :  Quand la concentration sanguine en glucose augmente, de l’insuline est sécrétée, celle-ci fait diminuer la concentration sanguine en glucose. Ainsi la concentration en glucose est stable, elle oscille autour d’une moyenne fixe. L’évolution : tous les individus sont en compétition pour des ressources limitées, ceux qui ont de « bons » gènes sont favorisés et se reproduisent. La descendance se trouve alors à nouveau en compétition. II) Notions de base 1) Energie L’énergie est la seule grandeur restant constante dans un système isolé. AU niveau macroscopique, l’énergie potentielle est l’énergie « de réserve » (par exemple une masse dans un champ de pesanteur). L’énergie cinétique est celle d’une masse en mouvement.  Au niveau moléculaire, Ec est l’agitation thermique des atomes et molécules (peu utilisable), la température indique la vitesse moyenne des molécules se trouvant dans un liquide. Ep est la réserve utilisée pour accomplir les différentes fonctions. Il existe 2 formes de stockage : molécules riches en énergie (glucides, lipides) et gradients de concentration de part et d’autre d’une membrane. Le gradient de concentration : les cellules ont une différence de potentiel ( 80 mV) de part et d’autre de leur membrane grâce au Na+ ( 140 mM à l’extérieur et 10 mM à l’intérieur de la cellule). Toute l’énergie n’est pas utilisable, seule une fraction G de l’énergie totale U est disponible. G ne peut que diminuer avec le temps dans un système isolé. (fig 4) ΔG = Gfinal - Ginitial < 0 ΔG < 0 pour un processus se produisant spontanément. On doit aussi introduire la notion d’entropie S (fig 5). Les objets ont de plus en plus tendance à devenir homogènes et moins complexes. Si W est le nombre d’états différents que peut prendre un système, S = k log (W) On a ΔG = ΔH - T ΔS (fig 7) Pour aller à l’encontre de cette loi et fabriquer des grosses molécules, la biosphère utilise l’énergie solaire (fig 6). Ainsi on peut coupler des réactions pour réaliser des réactions à ΔG > 0 comme la synthèse de macromolécules (protéines, acides nucléiques…) A B ΔG = +5 kcal/mol X Y + Z ΔG = -10 kcal/mol A + X B + Y + Z ΔG = -5 kcal/mol L’hydrolyse d’un ATP en ADP libère 7,3 kcal/mol par exemple. (fig 8 et 9) 2) Atomes et liaisons interatomiques Les atomes les plus importants dans la nature sont C, H, O et N (+ P et S). FH est l’acide le plus fort qui existe. L’eau est un bon solvant des molécules polaires. Une liaison double est une strucuture plane empéchant toute libre rotation (fig 14) Voir figures 11,12,13 pour les liaisons L’électronégativité polarise des liaisons, les électrons sont plus proches d’un des 2 atomes s’il ya une assez grande différence d’électronégativité (fig 15 et 16) Fig 17 pour les interactions entre atomes. Force de Van der Waals entre molécules apolaires (fig 18) :  Il existe dans un atome des régions plutôt riches en électrons et d’autres plutôt pauvres, ce qui permet des interactions. Lorsque les deux atomes sont trop rapprochés, la répulsion reprend le dessus (fig 18). Ces laisons étant faibles, il faut de grandes surfaces de contact pour qu’elles soient stables (exemple : elles sont utilisées pour les legos). Les alcanes ont tendance à s’empiler. Ces interactions sont aussi à l’origine de la viscosité de l’huile. Les interactions de van der Waals expliquent la dénaturation thermique des protéines. III) Les glucides et les lipides : autre prof IV) Les protéines 1) Importance des protéines chez les objets biologiques : Les protéines sont le bloc de construction des cellules, ce sont les machines leur permettant de fonctionner. Chez les eucaryotes elles représentent 58% du poids sec. - Role structural : les protéines du cytosquelette donnent la forme aux cellules, les protéines d’adhésion cellulaire leur permettent de s’associer entre elles pour former des tissus. (ex : myopathie, protéines d’adhésion non fonctionelles). Le collagène (cartillage,os,tendon) est une protéine fibreuse donnant la structure de l’os. La kératine est trouvée dans la peau et les cheveux - Role fonctionnel : les protéines ont un rôle de moteur moléculaire. *Les enzymes sont des catalyseurs biologiques augmentant la vitesse des réactions. Toute réaction, même thermodynamiquement favorable (ΔG < 0) nécessite un apport d’énergie préalable qui met les réactifs dans un état excité. C’est l’énergie d’activation. Les enzymes utilisent un autre mécanisme réactionnel permettant de diminuer la barrière d’énergie d’activation. A B sans enzyme, A A’ A’’ B avec enzyme. *Les récepteurs sont capables de fixer un ligand, et une fois la liaison effectuée ils envoient un signal modifiant le fonctionnement cellulaire * les transpeorteurs membranaires pompent les éléments et les font rentrer dans la cellule (glucose, acides aminés…) 2) Les acides aminés Les protéines sont constituées d’acides aminés (fig 21). Le carbone alpha est asymétrique (lié à 4 éléments différents) et il existe donc deux formes différentes : L et D. c’est la forme L qui est la plus répandue. pKa COOH = 2,1 à 2,6 et pKa NH2 = 9 à 10. Le pH isoélectrique est le pH auquel on aura le maximum de forme neutre. Il vaut (pKa1 + pKa2 ) / 2, où pKa1 et pKa2 sont les pKa entourant la forme neutre. Une protéine est un assemblage d’acides aminés, liés entre eux par des liaisons peptidiques (fig 23). Par convention, l’extrémité N terminale est à gauche et celle C terminale à droite (fig 31). Cette liaison a des formes de résonance : elle est donc plane (fig 24 et 25). On peut classer les acides aminés : a) Hydrophobes A, V, I, L : tous ont des libre rotations C-C. C’est le volume qui change F,W : cycles carbonés, F est légèrement chargé – et est ainsi très soluble dans l’eau M : le soufre n’étant pas électronégatif, S-C n’est pas une liaison polaire P : elle empêche la libre rotation de la liaison N-C dans une liaison peptidique. b) Chargés - Négativement : D (pKa 3,86) et E (pKa 4,25) . Le COOH de E est plus stable car O reçoit des électrons par effet inductif donneur de manière plus forte que D. - Positivement : K (pKa 10,5) et R (pKa 12) : la charge + de R est délocalisée, elle est portée par un groupement guanidinium. Enfin H a un pKa de 6, à pH physiologique une petite fraction est chargée positivement. c) polaires non chargés G : pas de carbone asymétrique, peu encombrant il se trouve dans des zones flexibles S et T : fonction OH C : ponts disulfures possibles S-S avec deux cystéines. Ceci permet des liaisons entre protéines (dimères) ou à l’intérieur d’une même protéine Y : phenylalanine + OH = phénol N et Q 3) Différents niveaux de structure de la protéine La protéine n’est fonctionelle que dans sa structure tertiaire, c'est-à-dire lorsqu’elle est repliée et a une structure 3D grâce à différentes forces et interactions : liaisons hydrogène, interactions hydrophobes (van der waals), liaisons ioniques, ponts disulfure (fig 27). Fig 19 : la liaison la plus importante est la liaison hydrogène. A chaque liaison peptidique, on a O et H susceptibles d’engendrer ces liaisons (voir fig 24 : le O de C=O et le H de N-H, fig 28). Les liaisons hydrogènes génèrent des structures secondaires. Elles permettent de former des hélices α. Dans celles-ci, les chaînes latérales R pointe toujours vers l’extérieur, et ainsi ne se gènent pas entre elles. Cette structure est très rigide dans le sens de la longueur mais se plie dans le sens de la largeur (ex : cheveux). Il y a environ 3,6 acides aminés par tour d’hélice (fig 30). Elles permettent aussi de former des feuillets β . On obtient des structures avec des groupements R de part et d’autre du plan (au-dessus et en-dessous) qui s’associent entre elles pour former des feuillets β (fig 32). Dans le cas des feuillets anti parallèles, on obtient une boucle sur laquelle peuvent se trouver des acides aminés importants  N term C term Les structures secondaires α et β s’associent entre elles pour former la structure tertiaire (fig 33). La structure quaternaire est un complexe protéique de plusieurs chaînes polypeptidiques associées (ex de Hb qui a 4 sites de fixation d’O2, fig 34) Le mécanisme permettant le repliement n’est pas encore connu, mais Afinsen dans les années 70 a prouvé que toute l’information nécéssaire au repliement était contenue dans la séquence d’acides aminés. Expérience : fig 35 : l’urée est un très puissant dénaturant, elle est extrêmement polaire et prend la place de c=O et N-H dans les liaisons hydrogène. Le mercaptoéthanol rompt les liaisons disulfure. Après élimination de l’agent dénatrurant par dialyse, la Rnase redevient fonctionelle (dégradation de l’ARN en présence). La protéine a donc repris sa structure initiale sans aide extérieure. Les protéines sont organisées en des domaines possédant des propriétés physico-chimiques différentes.  On a dans cet exmple un cœur hydrophobe stabilisé par liaisons de van der waals, et des boucles externes hydrophiles liées à l’eau, rendant la protéine soluble. 4) méthodes d’étude des protéines Pour étudier une protéine il faut pouvoir la purifier : on part d’un échantillon biologique puis on détruit la structure cellulaire (lyse). Lors de la purification on effectue des quantifications pour savoir combien de protéines on a. Ceci permet de savoir comment a progressé la purification :  Les méthodes spectrophotométriques sont basées sur la propriété des protéines à absorber la lumière : les atomes (au niveau des électrons qui changent d’orbitale) absorbent l’énergie que contiennent des photons de certaines énergies quantifiées (fig 36). Chez les protéines, la tyrosine et le tryptophane (la phénylalanine aussi mais beaucoup moins) absorbent dans des longueurs d’ondes très courtes (UV). Ce sont tous des acides aminés aromatiques. L’ADN contient des bases semblables ce qui explique la dangerosité des UV pour la peau. Y et W absorbent à 270 – 280 nm. (fig 37). On se sert d’un spectrophotomètre pour étudier cela (fig 38) : Le prisme déforme les longueurs d’ondes de la lumière incidente, il permet d’envoyer une seule longueur d’onde définie à l’horizontale (passant à travers la fente). La quantité de lumière absorbée est proportionelle à la concentration au maximum d’absorption : DO = log ( I0 / It ) = ε [C] L DO : densité optique I0 : lumière incidente It : lumière transmise L = longueur de la cuve ε : coefficient d’extinction molaire La dialyse permet de différencier par la taille. (fig 39) Le tamisage moléculaire (fig 40) : pas de membrane de dialyse mais billes poreuses dérivées du dextron. Les molécules peuvent diffuser à l’intérieur des billes. Il existe différentes tailles de pores : les petites molécules rentrent et sont piégées, les grosses ne rentrent pas et sont receuillies les premières. La chromatographie d’échange d’ions (fig 41) permet de trier les protéines selon leur charge. La chromatographie d’affinité (fig 42) est basée sur la fonction biologique. Un logand est greffé sur une bille et les protéines ayant une affinité avec ce ligand sont fixées. Pour les décrocher on introduit des ligands libres, qui pourront ensuite être enlevés par dialyse ou tamisage. L’électrophorèse en condition non dénaturante (fig 43) : les protéines migrent vers le pôle + ou le pôle – selon leur charge. Plus la charge est importante, plus la vitesse de migration est élevée. Mais la forme influe sur la vitesse de migration. L’électrophorèse en condition dénaturante (fig 44) consiste à débobiner la protéine grâce à un chauffage + détergent qui entoure alors la protéine d’une gaine chargée - . Placées dans un gel, les protéines migrent grâce à un champ électrique vers le pôle +. Plus les protéines sont grandes, moins elles migrent rapidement à travers le gel. |
