Objectif du projet
L’objectif général de ce projet est d’évaluer, à partir d’une enquête épidémiologique, le rôle d’interactions gène-environnement dans l’étiologie des fentes orales.
Les études d’interaction gène-environnement en épidémiologie permettent d’évaluer les contributions séparées et simultanées des gènes et de l’environnement sur la maladie. Ces études permettent de clarifier des mécanismes biologiques de la maladie chez l’homme, pertinents au gène et au facteur environnemental étudiés, identifiant ainsi des chemins et des facteurs causaux à la maladie. Elles peuvent aider à déterminer quel composant spécifique dans une situation d’exposition complexe et multiple à laquelle les hommes sont exposés, joue un rôle dans la survenue de la maladie. L’utilisation de ces hypothèses de mécanismes biologiques permet en conséquence de développer des stratégies thérapeutiques et préventives plus ciblées.
La seule identification de gènes de susceptibilité à une maladie fournit des preuves directes que ces gènes et leurs mécanismes biologiques associés sont pertinents à l’explication de la maladie. Cependant, l’identification des interactions gène-environnement permet, de plus, d’individualiser les stratégies de prévention (en modulant par exemple, avant le diagnostic de la maladie, l’exposition environnementale chez les sujets possèdant le gène de susceptibilité) et de traitement (en offrant un traitement personnalisé de la maladie).
Une interaction gène-environnement sera acceptée si elle peut être reproduite dans plusieurs études épidémiologiques et si l’effet semble plausible au niveau biologique.
Ce projet permettra de contribuer à la connaissance du rôle d’interactions gène-environnement dans l’étiologie des fentes orales nonsyndromiques. Il s’appuie sur une étude cas-témoins menée en France entre 1998 et 2001, intégrant un schéma d’étude cas-parents.
Il cible plus spécifiquement certains facteurs environnementaux déjà soupçonnés dans la littérature épidémiologique des fentes orales.
Le choix des gènes d’intérêt a été fait a priori pour tenir compte d’une part des voies de métabolisme et de détoxication des expositions environnementales identifiées comme facteurs de risque (ou facteurs protecteurs), et d’autre part des gènes récemment soupçonnés d’avoir un rôle dans la formation embryonnaire des fentes orales chez l’homme ou l’animal.
Les effets génétiques maternels indirects (pouvant modifier l’environnement intra-utérin du fœtus) seront évalués et distingués des effets directs du génotype de l’enfant..
Matériel & Méthodes
1
Population
Le projet s’appuie sur une étude épidémiologique cas-témoins mise en place à partir de services hospitaliers de chirurgie pédiatrique en France, entre 1998 et 2001.
.AEnquête épidémiologique . 1.Recrutement des sujets ..i.Les cas
Les cas sont des enfants atteints de fente labiopalatine (FL/P) ou de fente palatine isolée (FP), traités par chirurgie maxillo-faciale dans un des services suivants :
A Paris : Hôpital Trousseau (Pr M-P Vazquez)
A Lyon : Hôpital de la Croix-Rousse (PrL-L Béziat), Hôpital Debrousse (Pr C Paulus), Hôpital Edouard Herriot (Pr J-P Chappuis), Clinique du Val d’Ouest (Dr I James-Pangaud)
A Clermont-Ferrand : CHU (Pr J-M Mondié)
A Grenoble : CHU (Pr B Raphael)
Entre septembre 1998 et février 2001, 263 mères d’enfants atteints de fentes orales (syndromiques ou non syndromiques) ont été interrogées à l’hôpital. Plus de 50% du recrutement proviennent des hôpitaux Lyonnais et 30% de l’Hôpital Trousseau à Paris (Tableau 20). Un total de 37 enfant-cas éligibles n’a pu être inclus dans l’étude. La cause majeure de non-inclusion est le problème de maîtrise de la langue française ; d’autres raisons peuvent également être évoquées : refus de participation, problèmes pratiques d’emplois du temps avec les mères, et absences d’interview pour cause de décès post-opératoire ou d’abandon de l’enfant.
Les cas se répartissent en 23 cas syndromiques (treize séquences Pierre Robin, trois Van der Woude, trois Di George, un Stickler, un Kabuki, un Aarskog et un syndrome orodigitofacial), 76 fentes palatines et 164 cas de fentes labio-palatines. Nous retrouvons les caractéristiques attendues pour cette population d’enfants atteints : deux fois plus de FL/P que de FP, et une prédominance de garçons parmi les FL/P (cf section suivante Description de la population et le Tableau 20).
..ii.Les témoins
Le protocole prévoyait le recrutement d’enfants témoins admis dans les mêmes hôpitaux que les cas, pour des raisons autres que malformations, cancers ou maladies génétiques, et pour lesquelles les nécessités du service prévoyaient un prélèvement de sang. Les enfants devaient, en outre, être appariés aux cas sur le sexe, l’âge ( 1 mois), l’éloignement du lieu de résidence au bassin de recrutement de l’hôpital et l’origine géographique de la mère.
De nombreuses difficultés se sont présentées pour le recrutement de témoins hospitalisés et la collecte de leurs prélèvements biologiques. Dans la majorité des services de chirurgie pédiatrique initialement prévus par le protocole, peu d’enfants avec un « diagnostic bénin » sont admis dans les tranches d’âge requises par le protocole d’étude, ce qui a rendu difficile le recrutement d’enfants répondant à l’ensemble des critères attendus de témoin. Il a été nécessaire d’élargir le recrutement des enfants-témoins à d’autres hôpitaux dans l’étude, comme l’hôpital Debrousse à Lyon, et à des services hospitaliers non chirurgicaux. De plus, pour le cas spécifique de l’hôpital Trousseau de Paris spécialisé dans les maladies sévères de l’enfance, tous les enfants-témoins ont été recrutés dans les maternités locales de Tenon et Rothschild. Le choix de recruter des enfants-témoins dans des maternités nous a amené à relaxer le critère d’appariement sur l’âge. Enfin, malgré cet élargissement du recrutement, l’appariement des enfants-témoins avec les enfants-cas sur le lieu de résidence (dans le bassin de recrutement de l’hôpital ou dehors) n’a pas toujours été réalisé.
Nous avons été confrontés au problème d’absence des autorisations nécessaires dans les services pour des prélèvements sanguins sans bénéfice individuel direct pour le sujet, car l’autorisation donnée par le CCPPRB (Comité Consultatif de Protection des Personnes dans la Recherche Biomédicale) exige que le prélèvement ne soit effectué qu’en plus d’un autre déjà prévu pour les besoins du service. Avec l’accord supplémentaire de la CNIL (Commission Nationale de l'Informatique et des Libertés) obtenue en août 2000, nous avons alors pris la décision de demander aux mères d’enfants-témoins l’autorisation d’utiliser le prélèvement de tâches de sang fait à la naissance pour le test de Guthrie. Munis des consentements des mères, nous n’avons eu, dès lors, aucune difficulté à obtenir les buvards des tests de Guthrie, excepté pour Paris où la Fédération Parisienne pour le Dépistage a exigé un second consentement écrit des familles et a refusé l’accès aux buvards lorsque les familles n’avaient pas réaffirmé leur accord.
Finalement, les témoins éligibles à cette étude sont les enfants-témoins appariés avec les enfants-cas sur le centre, le sexe et l’origine géographique des mères (ainsi que l’âge et le lieu de résidence, selon les contraintes pratiques), présents à l’hôpital à la visite de l’enquêteur et contactés pour la collecte d’informations. Parmi les familles de témoins éligibles à cette étude, 25 familles ont refusé de participer. Toutes ces difficultés et les retards qu’elles ont entraînés, font que le recrutement des témoins s’est poursuivi au delà de la fin du recrutement des enfants-cas (interview de janvier 2000 à décembre 2001), et que le nombre de témoins recrutés est légèrement inférieur à celui des cas. Un total de 236 témoins a été inclus dans l’étude, dont 80 enfants sont issus des maternités parisiennes. Les causes d’hospitalisation des 156 témoins hospitaliers sont précisées en Annexe 2.
. 2.Collecte d’informations ..i.Questionnaire à la mère
L'interview des mères de cas et de témoins s’est tenue à l'hôpital au moyen d'un questionnaire standardisé. Les questions portaient sur les variables socio-démographiques (âge des parents, niveau d'études, pays d'origine, lieu de résidence), l'histoire médicale et obstétricale de la mère, l'histoire familiale de fentes orales (pour les cas), les maladies infectieuses ou les prises de médicaments (incluant les suppléments vitaminiques), les expositions médicales aux rayons X et les chirurgies, l'alimentation habituelle, la consommation de tabac et d'alcool, l'exposition passive au tabac, les professions et les expositions professionnelles, les expositions domestiques à des produits chimiques (en particulier solvants). Pour l'ensemble des expositions, quatre périodes de temps ont été considérées : période préconceptionnelle (débutant 1 mois avant la grossesse), 1er, 2ème et 3ème trimestres de grossesse.
La construction de ce questionnaire s’est appuyée sur un certain nombre de questionnaires et de méthodes d'évaluation des expositions d’études précédentes : (1) Cordier et al. (1997) pour l’évaluation des expositions professionnelles aux solvants – avec l’aide d’une description complémentaire des tâches professionnelles pour certaines professions des mères, (2) Lorente et al. (2000) pour l’évaluation des consommations d’alcool et de tabac, (3) Frelut et al. (1995) pour le questionnaire alimentaire ciblé sur l’apport en folates. Ce questionnaire alimentaire est un questionnaire de fréquence, il est basé sur la distribution de plusieurs groupes d’aliments contenant des folates et consommés en France. Ces groupes d’aliments incluent les céréales pour petit déjeuner dont le contenu moyen en acide folique les classe parmi les aliments contribuant à l’apport. Ce questionnaire est croisé avec une table de composition alimentaire. Les expositions domestiques aux solvants au cours de la grossesse ont été évaluées en fonction de l'utilisation déclarée de certains produits (peintures, vernis, produits de nettoyage, cosmétiques).
..ii.Evaluation des expositions professionnelles
Pour l’évaluation des expositions professionnelles, l'ensemble des réponses aux questionnaires a été revu par un expert chimiste en aveugle du statut cas-témoins, lequel a attribué à chaque exposition trois paramètres : fréquence, concentration et fiabilité de l’exposition.
Les expositions principalement évaluées étaient les solvants, les composés du plomb, les gaz propulseurs, les radiations ionisantes et non-ionisantes. Les trois principales classes chimiques de solvants ont été détaillées :
en 5 sous-classes pour la classe des solvants oxygénés : alcools aliphatiques, aldéhydes aliphatiques, esters aliphatiques, cétones aliphatiques et éthers de glycol,
en 2 sous-classes pour les solvants chlorés : alcanes et alcènes chlorés,
en 3 produits pour les solvants pétroliers : essences minérales, hydrocarbures aromatiques mononucléaires, carburants.
.BInformations génétiques . 1.Prélèvements biologiques
Des prélèvements de sang ont pu être obtenus pour 408 enfants (82% des enfants inclus dans l’étude) ; pour 285 d’entre eux, un prélèvement est également disponible pour la mère. Des échantillons sanguins ont été collectés à la fois chez l’enfant et ses deux parents pour 212 familles.
Tableau 18: Support de prélèvement sanguin par catégorie de sujets (France, 1998-2001)
Effectif
|
Prélèvement veineux
|
Buvard épais (Isocode card)
|
Buvard du test de Guthrie
|
Total de prélèvement disponible
|
%*
|
Familles d’enfant atteint de fente orale non syndromique (+ syndromique)
|
Enfant
|
200 (+21)
|
14
|
0
|
214 (+21)
|
89%
|
Mère
|
217 (+21)
|
0 (+1)
|
0
|
217 (+22)
|
90%
|
Père
|
204 (+22)
|
1
|
0
|
205 (+22)
|
85%
|
Familles d’enfant témoin
|
Enfant
|
12
|
18
|
143
|
173
|
73%
|
Mère
|
42
|
14
|
6†
|
62
|
26%
|
Père
|
0
|
0
|
0
|
0
|
-
|
* Pourcentage de sujet ayant un prélèvement sanguin disponible, parmi les sujets inclus dans l’étude (240 cas non syndromiques et 236 témoins)
† exceptionnellement pour le prélèvement sanguin de six mères d’enfant-témoin, nous avons eu recours à des buvards utilisés pour les tests de Guthrie
|
Différents supports de prélèvements sanguins ont été utilisés selon les sujets. Nous avons eu recours à des prélèvements veineux pour la majorité des enfants-cas et leurs parents, et pour les mères des enfants-témoins. Les buvards des tests de Guthrie nous ont permis d’obtenir des prélèvements sanguins pour la majorité des enfants-témoins. Des buvards épais (Isocode cards, Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA) adaptés aux techniques d’extraction d’ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction) ont permis de compléter le recueil de ces informations lorsque le prélèvement veineux n’était pas adapté (Tableau 18).
. 2.Génotypage
Les polymorphismes d’intérêt ont été génotypés dans leur majorité par le laboratoire U525 (« Génétique épidémiologique et moléculaire des pathologies cardiovasculaires », Faculté de Médecine de la Pitié Salpetrière, Paris, France) de l’Inserm, suivant différentes techniques adaptées aux spécificités des polymorphismes d’intérêt.
Pour chaque polymorphisme, l’ADN génomique de chaque individu a été amplifié par PCR, cet ADN génomique étant directement extrait à partir du sang, ou bien à partir de buvards Isocode Card ou Guthrie préalablement amplifié par DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide Primed amplification/Polymerase Chain Reaction), technique décrite par Barbaux et al (2001) (puis détaillée dans Chevrier et al. 2005).
Le génotypage a été réalisé pour la majorité des polymorphismes étudiés (ADH1C Ile349Val, CYP1A1 I462V, CYP1A1 T+1189C, MSX1 T+2090G, MTHFR C677T, TGFα Taq1, TGFβ3 T-24 in4C) par la technique des ASO (Allelic Specific oligonucleotid) décrite par Saiki et al. (1986) à l’aide de sondes spécifiques de l’allèle muté et de l’allèle sauvage, marquées radioactivement. Cette technique consiste à hybrider, dans un premier temps, la sonde mutée sur le produit de PCR de chaque individu, préalablement blotté sur une membrane. Après déshybridation, l’hybridation de la sonde sauvage est réalisée sur le même produit de PCR. Un signal uniquement avec la sonde sauvage est observé pour un génotype homozygote sauvage, un signal uniquement avec la sonde mutée pour un génotype homozygote muté, et un signal simultané avec les deux sondes pour un généotype hétérozygote.
Les deux polymorphismes du gène CYP2E1, DraI et RsaI, engendrent une disparition d’un site de coupure par les enzymes de restriction respectives DraI et RsaI. Le génotypage a été réalisé par digestion enzymatique du produit de PCR par ces enzymes, comme décrit par Sarmanova et al. (2001).
Pour les gènes GSTM1 et GSTT1, les polymorphismes d’intérêt se définissent par la délétion d’une région génomique dans laquelle se trouve ces gènes. Lorsqu’un individu porte cette délétion, l’amplification par PCR ne peut pas avoir lieu. Les produits de PCR ont été déposés sur gel d’agarose, puis deux génotypes ont été déterminés directement par l’absence (i.e. délétion à l’état homozygote, appelée génotype Null) ou la présence (i.e. présence du gène à l’état hétérozygote ou homozygote) de l’amplification, comme décrit par Arand et al. (1996).
Des difficultés du laboratoire U525 d’amplification d’ADN à partir des buvards de test de Guthrie ont abouti à un grand nombre d’informations génétiques manquantes dans le groupe de témoins, puisque la majorité de ce groupe est concernée par ce type de support (plus de 50% de valeurs manquantes parmi les Guthrie pour l’ensemble des polymorphismes, excepté les gènes ADH1C et TGFβ3). Ces taux élevés d’informations génétiques manquantes dans le groupe de témoins nous ont conduits à ne pas exploiter les analyses cas-témoins, se préservant, de la sorte, d’un risque sévère de biais de sélection et d’un manque certain de puissance statistique.
Nous avons eu recours à deux autres laboratoires (Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University System Health Science Center, Houston, Texas, U.S.A. ; et Birth Defects Research Lab, Children's Hospital Oakland Research Institute (CHORI), Oakland, CA, U.S.A.) réalisant, tous deux, des extractions d’ADN en routine à partir d’une quantité infime de matériel sanguin.
Le polymorphisme MTHFR C677T pour le laboratoire de Houston et les polymorphismes GSTM1 et GSTT1 pour le laboratoire d’Oakland, ont ainsi été déterminés à nouveau pour l’ensemble des buvards épais ou de Guthrie, utilisés pour les enfants, par des techniques d’enzyme de restriction (Frosst et al. 1995, Arand et al. 1996). Pour chacun de ces polymorphismes, le groupe de sujets génotypés avec succès par l’U525 et par le laboratoire américain a été défini comme échantillon de validation, contenant 76 échantillons communs pour le gène MTHFR (32 buvards épais et 44 buvards Guthrie) et 32 échantillons communs pour les deux polymorphismes de GST (puisque aucun buvard de Guthrie n’a pu être génotypé par l’U525). La stratégie adoptée était alors de valider le double génotypage si le taux de concordance des résultats de génotypage sur l’échantillon de validation était supérieur à 95%. Cette limite, fixée par Little et al. (2002), permet de satisfaire à une bonne qualité des données génétiques. Une discordance a été observée pour le polymorphisme C677T du gène MTHFR (parmi 76 échantillons communs), et aucune discordance (parmi 32) pour les deux polymorphismes de GST. Le sujet concerné par la discordance a été exclu de l’analyse portant sur le gène MTHFR.
Les personnels des laboratoires de génotypage ont travaillé à l’aveugle du statut cas-témoins et enfant-parent. Le laboratoire U525 de l’Inserm a procédé à une relecture des génotypes et une double saisie des résultats. En revanche, aucun des trois laboratoires n’a réalisé d’échantillon interne de validation, comme il est pourtant recommandé par Little et al. (2002), répertoriant les bonnes pratiques à suivre pour des informations génétiques reproductibles et fiables.
. 3.Effectifs des informations génétiques disponibles
Quelques incohérences de transmission familiale ont pu être détectées parmi les génotypes déterminés, mais leur effectif reste très limité (n=2 familles pour ADH1C, n=3 pour CYP2E1, n= 2 pour CYP1A1, n=3 pour MTHFR, n=2 pour les GST, n=2 pour TGF, n=2 pour TGF3, n=3 pour MSX1). Lorsque des incohérences sont observées pour plusieurs polymorphismes, nous choisissons d’exclure ces familles de l’ensemble des analyses faisant intervenir l’information génétique (n=2 familles). Ces incohérences peuvent, par exemple, révéler post-hoc des problèmes de paternité non vérifiée ; ces familles doivent alors être exclues. Lorsque ces incohérences sont isolées à un seul polymorphisme, nous choisissons d’exclure ces familles des analyses pour l’étude de ce polymorphisme. Ces incohérences isolées peuvent traduire des erreurs de génotypage.
L’effectif final des informations génotypiques disponibles est présenté dans le Tableau 19 pour chaque polymorphisme.
Tableau 19 : Effectifs des informations génétiques disponibles
|
|
Témoins
|
Cas non syndromiques
|
|
|
n=236
|
n=240
|
|
|
Enfant
|
Mère
|
Enfant
|
Mère
|
Père
|
Triade*/Diade**
|
Nombre de prélèvements sanguins
|
173
|
62
|
214
|
217
|
205
|
191
|
/ 16
|
Gène
|
Nom précis des polymorphismes issus du génotypage
|
Noms des formes sauvage/mutée issus de nomenclature
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Gènes « métabolisateurs »
|
|
|
|
|
|
|
|
ADH1C
|
Ile349Val
|
*1 / *2
|
115
|
54
|
205
|
211
|
195
|
174
|
/ 23
|
Cyp2E1
|
RsaI ou C-1053T
|
*1 / *5
|
38
|
50
|
204
|
208
|
195
|
175
|
/ 21
|
|
DraI
|
*1A / *6
|
21
|
40
|
194
|
206
|
191
|
160
|
/ 27
|
Cyp1A1
|
Ile462Val
|
*1A / *2C
|
41
|
51
|
206
|
211
|
195
|
175
|
/ 23
|
|
T+1189C
|
*1A / *2A
|
43
|
45
|
200
|
209
|
194
|
171
|
/ 21
|
GSTM1
|
Grande délétion
(état homozygote)
|
Wild / Null
|
165
|
55
|
209
|
211
|
196
|
179
|
/ 22
|
GSTT1
|
Grande délétion
(état homozygote)
|
Wild / Null
|
165
|
55
|
208
|
211
|
196
|
179
|
/ 22
|
MTHFR
|
Ala677Val ou C677T ou HinfI
|
C / T
|
168
|
59
|
207
|
209
|
195
|
176
|
/ 23
|
Gènes du développement embryonnaire
|
TGFα
|
TaqI
|
C1 / C2
|
23
|
41
|
203
|
207
|
196
|
172
|
/ 23
|
TGFβ3
|
T24 in4C
(ou X5.1)
|
|
90
|
54
|
206
|
210
|
195
|
175
|
/ 23
|
MSX1
|
T+2090G
|
|
30
|
45
|
192
|
205
|
186
|
160
|
/ 22
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
*Triade : famille avec les génotypes déterminés de l’enfant et des deux parents
|
**Diade : triade avec un génotype parental manquant
|
. 4.Nomenclature
Les noms des gènes cités dans ce projet satisfont à la nomenclature des gènes approuvée par le HGNC, HUGO Gene Nomenclature Committee (à la date de janvier 2005). Cette base de données de gènes humains (Human Gene Nomenclature Database) est disponible à l’adresse suivante : http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/.
La notation des SNPs (Single-Nucleotide Polymorphisms) est fonction de la position de la mutation sur le brin d’ADN et des nucléotides ou acides aminés associés qui y sont substitués. Par exemple, le polymorphisme Ile349Val du gène de l’alcool déshydrogénase ADH1C correspond à un remplacement des acides aminés de l’isoleucine par la valine à la position 349, le polymorphisme de la MTHFR C677T est défini par la substitution du nucléotide C par T à la position 677.
Pour les cytochromes P450, qui constituent une famille importante de gènes, nous adoptons la nomenclature allélique recommandée à la suite d’un consensus établi entre deux systèmes différents de nomenclatures (Antonarakis 1998, Nebert 2000, Ingelman-Sundberg et al. 2001). Ces données sont disponibles à l’adresse suivante : http://www.imm.ki.se/CYPalleles/. Il est recommandé d’écrire les génotypes par la combinaison des notations des allèles séparée par « / » (par exemple pour le CYP2E1*DraI, l’état homozygote-muté est noté CYP2E1*6/*6, hétérozygote, CYP2E1*1A/*6, homozygote-sauvage CYP2E1*1A/*1A, où CYP2E1*1A est l’allèle sauvage).
La notation de l’allèle CYP2E1*5 (ou *RsaI) est issue de la nomenclature de Garte et Crosti (1999). Il est inclus dans deux haplotypes, notés *5A et *5B, dans la nouvelle nomenclature. Dans notre étude, le polymorphisme d’intérêt est un SNP correspondant à la substitution suivante C1053T. Nous l’étudions en tant que tel.
Pour reconnaître l’enzyme du gène, il est convenu de noter les gènes en italique (par exemple l’alcool déshydrogénase ADH est l’enzyme codée par le gène nommé aussi ADH).
2
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