Rapporteurs

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3. Cultures de fibroblastes 80

Culture 80
Analyse du temps de doublement des fibroblastes 81

4. Mesure de l'activité PIP₂ 5-phosphatase 81

Préparation de l'extrait cellulaire 81
Préparation du phosphatidyl-inositol-(4,5)-diphosphate tritié 82
Dosage 82

5. Production d'anticorps dirigés contre la protéine OCRL1 83

Anticorps anti N et C terminaux de la protéine OCRL1 83

Production du vecteur d'expression 83

Construction du vecteur d'expression 83
Transformation bactérienne 84
Minipréparation d'ADN plasmidique 84
Maxipréparation d'ADN plasmidique 85

Expression des fragments N et C terminaux de la protéine OCRL1 86

Anticorps antipeptide dirigé contre l'extrémité C terminale 86

Production 86

Contrôle par Western Blot 87
Purification des anticorps 87

6. Analyse de la protéine OCRL1 par Western Blot 89

Préparation des échantillons 89
Western blot 89

III. RESULTATS ET DISCUSSION-----------------------------------92

A. Etudes moléculaires et génétiques 92

1. Nomenclature : état des lieux et correctifs 92
2. Identification de mutations chez les patients atteints de Syndrome de

Lowe 93

Type de mutation 97
Fréquence des mutations 98
Distribution des mutations 99
Dépistage des conductrices 101
Mutations de novo 101
Absence d'identification de mutation 102
Bilan de détection 103

3. Description et discussion des mutations chez les patients atteints de Syndrome de Lowe 103

Délétions en phase 103
Mutations faux sens 104
Mutations affectant un site d'épissage 110

Mutations situées au niveau du site donneur d’épissage 110
Mutations situées au niveau du site accepteur d’épissage 114
Mutations aux bornes de l'exon 116
Mutations introniques 118

Délétions génomiques 120
Mutations non sens et mutations responsables d'un décalage du cadre de

lecture 124

4. Identification et description des mutations chez les patients atteints de maladie de Dent 125

Mutations faux sens 127
Mutation d'épissage 128
Délétion génomique 129

5. Haplotypage et mosaïques germinales 131
B. Corrélation génotype-phénotype 138

1. Corrélation génotype-phénotype clinique 138
2. Analyse du morphotype des fibroblastes mutés – temps de doublement 146
3. Mesure de l'activité PIP₂ 5-phosphatase des fibroblastes mutés 149
4. Analyse par Western blot de la protéine OCRL1 154
5. Analyse des transcrits d'OCRL1 159

6. Continuum syndrome de Lowe – maladie de Dent 165
IV. CONCLUSION-------------------------------------------------------167

V. BIBLIOGRAPHIE----------------------------------------------------174

VI. ANNEXE---------------------------------------------------------------186

SOMMAIRE DES FIGURES ET TABLEAUX

FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique du gène OCRL1…………………………………….17

Figure 2 : Séquence des exons du gène OCRL1 et leurs bornes introniques………………...20

Figure 3 : Séquence de l'ADNc d'OCRL1……………………………………………………22

Figure 4 : Séquence de la protéine OCRL1…………………………………….……………23

Figure 5 : Modèle du site 5-phosphatase d'OCRL1………………………………………….24

Figure 6 : Représentation schématique de différentes 5-phosphatases………………………25

Figure 7 : Métabolisme partiel des phosphatidylinositol phosphates………………………..26

Figure 8 : Les différents domaines de la protéine OCRL1…………………………………..27

Figure 9 : Différents domaines d'OCRL1 et leurs interactions protéiques…………………..31

Figure 10 : Schéma d'un phosphoinositide…………………………………………………..33

Figure 11 : Localisation intracellulaire des 5-phosphatases…………………………………41

Figure 12 : Dendrogramme de la superfamille des petites protéines G……………………...43

Figure 13 : Le cycle des GTPases…………………………………………………………....45

Figure 14 : Photographie de deux enfants atteints de syndrome de Lowe…………………...55

Figure 15 : Autoradiographie d'un gel de SSCA……………………………………………..74

Figure 16 : Profil chromatographique de l'exon 12…………………………………………..75

Figure 17 : Purification du peptide recombinant Nter………………………………...……..88

Figure 18 : Caractérisation des peptides recombinants N et C terminaux de la protéine OCRL1………………………………………………………………………………………..88

Figure 19 : Corrections de la localisation du début de la partie codante du gène OCRL1…..92

Figure 20 : Distribution des mutations par type……………………………………………...98

Figure 21 : Distribution des mutations identifiées dans notre étude et la base de données...100

Figure 22 : Répartition des mutations faux sens sur le gène OCRL1……………….………105

Figure 23 : Blocs de séquences d'acides aminés hautement conservés partagés par 5 phosphoinositide et inositol polyphosphate 5-phosphatases humaines……………………..107

Figure 24 : Alignement du domaine Rho-GAP d'OCRL1 avec 5 autres protéines de la

famille Rho-GAP……………………………………………………………………………109

Figure 25 : Conséquence de la mutation c.1551+1G>A…………………………………....111

Figure 26 : Conséquence de la mutation c.2530+1G>C……………………………………112

Figure 27 : Conséquences protéiques de la mutation c.2418+2T>G……………………….113

Figure 28 : Conséquences attendues des mutations affectant le site accepteur consensuel d'épissage……………………………………………………………………………………115

Figure 29 : Conséquences attendues des mutations aux bornes de l'exon………………….117

Figure 30 : Analyse par RT-PCR de la mutation c.1415G>A……………………………...118

Figure 31 : Conséquence protéique de la mutation c.889-11G>A………………………….119

Figure 32 : Conséquence protéique de la mutation c.1828+5G>A…………………………119

Figure 33 : Conséquence protéique attendue de la mutation c.1416-3C>G………………..120

Figure 34 : Caractéristique de la délétion des exons 5 à 8………………………………….122

Figure 35 : Délétion des exons 8 à 12………………………………………………………122

Figure 36 : Caractéristiques du fragment de jonction de la délétion des exons 6 à 12……..123

Figure 37 : Conséquence de la mutation p.Asn857AsnfsX34……………………………...124

Figure 38 : A. Distribution et nature des mutations identifiées dans notre étude…………..125

Figure 39 : Blocs de séquences d'acides aminés hautement conservés partagés par 5 phosphoinositide et inositol polyphosphate 5-phosphatases humaines…………….……….128

Figure 40 : Mutation d'épissage au sein de l'intron 1……………………………………….130

Figure 41 : Ségrégation de la mutation p.Arg483Gly et des marqueurs du chromosome

X dans la famille n° 1………………………………………………………………………..133

Figure 42 : Ségrégation de la mutation c.1415G>A et des marqueurs du chromosome

X dans la famille n° 2……………………………………………………………………….135

Figure 43 : Ségrégation de la mutation p.Arg646Stop et des marqueurs du chromosome

X dans la famille n° 3………………………………………………………………………..137

Figure 44 : Questionnaire clinique sur le syndrome de Lowe……………………………...140

Figure 45 : Culture de fibroblastes……………………………………………….…………146

Figure 46 : Analyse du temps de doublement de fibroblastes normaux et mutés…………..147

Figure 47 : Autoradiographie de la plaque de chromatographie……………………………149

Figure 48 : Représentation schématique des résultats du dosage de l'activité PIP₂ 5-phosphatase d'OCRL1……………………………………………………………………….150

Figure 49 : Analyse par Western blot de la protéine OCRL1………………………………156

Figure 50 : Analyse par PCR quantitative des transcrits d'OCRL1…………………………161

Figure 51 : Analyse par PCR quantitative des transcrits de GAPDH……………………....162

Figure 52 : Représentations graphiques des quantités d'ARNm d'OCRL1 par rapport aux quantités d'ARNm de GAPDH………………………………………………………………163

Figure 53 : Représentations graphiques, en fonction du type de mutation, des quantités d'ARNm d'OCRL1 par rapport aux quantités d'ARNm de GAPDH et inversement………...164