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Tableau 5 : Nom et séquences des amorces utilisées pour l'amplification et le séquençage de l'ADNc.
Les fragments amplifiés sont tout d'abord purifiés afin d'éliminer les amorces et dNTP en excès. A 10 µl d'amplifiat, 2 µl de l'enzyme ExoSAP-IT (Amersham) sont rajoutés. Le mélange est centrifugé puis incubé 15 min à 37°C puis15 min à 80°C. Les étapes suivantes : réaction de séquence, nouvelle purification et séquençage sont réalisées en suivant les instructions du fournisseur du kit BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit™ (Applied Biosystems). L'analyse et l'interprétation des résultats sont réalisées sur le séquenceur ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).
Les ARN totaux sont extraits à partir de cellules fibroblastiques au stade de confluence. Après récolte par trypsination et lavage dans 5 ml de PBS 1X, les cellules sont comptées à l'aide d'une cellule de Neubauer et l'équivalent de 2 à 5 x106 cellules est repris par 1 ml de Trizol® (Invitrogen). Après ajout de 0,4 ml de chloroforme, le mélange est homogénéisé par retournement, incubé 3 minutes à température ambiante puis centrifugé 15 minutes à 12 000 g et à 4°C. L'ARN obtenu dans la phase supérieure aqueuse est précipité par 0,5 ml d'isopropanol, incubé 10 minutes à température ambiante puis centrifugé 10 minutes à 12 000 g et à 4°C. Après élimination de l'isopropanol, le culot est lavé par 1 ml d'éthanol 80 % (v/v, H2O DEPC) puis centrifugé 5 minutes à 7500 g et à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est séché à l'air libre pendant 5 à 10 minutes. L'ARN est solubilisé par 50 µl d'H2O DEPC et 0,5 µl de RNAse Inhibitor® (40 U/µl, Roche). La qualité des ARN est contrôlée sur gel d'agarose 1,5 % (p/v) et les aliquots de 5 et 10 µl sont conservés à –80°C. Le premier brin d'ADNc est synthétisé à partir de 0,2 µg d'ARN total dans un volume final de 20 µl en utilisant 50 U d'Expand Reverse Transcriptase® (Roche), 40 pmoles d'une amorce spécifique (5'-aactttggcttggcaatataagtc) et 0,1 µg d'oligodt à 48°C pendant 1 heure.
Deux PCR sont réalisées à partir de 2 µl d'ADNc de chaque patient dilué au ½ et au 1/10 en utilisant un système d'amorces spécifiques du gène OCRL1 (amorce F (ls 2364F) : 5'-cgagctgtatcagcgatgtc-3' et amorce R (ls 2564R) : 5'-ggaggcctcaggagaagact-3') et un système d'amorces spécifiques du gène de la GAPDH (glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, GAPDH F : 5'-catcaagaaggtggtgaagc-3' et GAPDH R : 5'-gagcttgacaaagtggtcgt-3'), gène utilisé comme contrôle. Les amorces ont été choisies de façon à obtenir, pour chaque PCR, un fragment d'amplification de 200 paires de bases dont les extrémités sont situées dans 2 exons différents (exons 21 et 23 pour OCRL1 et 8 et 9 pour GAPDH) afin d'éviter toute amplification génomique. Afin de permettre une quantification, une gamme est réalisée pour chaque PCR à partir d'un témoin de concentration connue obtenu par amplification dans des conditions standards par les mêmes systèmes d'amorces, purification des amplifiats (colonne Microcon®) et dosage de la concentration par spectrophotométrie. Pour chaque PCR, dans un volume final de 25 µl, les dilutions d'ADNc sont mélangées à 12,5 µl de IQTM SYBR® Green Supermix 2X (Biorad) et 12,5 pmoles de chaque amorce puis amplifiées selon le protocole suivant : 3 minutes de dénaturation initiale à 95°C, 40 cycles de 30 secondes de dénaturation à 95°C suivie d'une phase combinée d'hybridation des amorces et d'élongation de 45 secondes à 58°C pour le gène OCRL1 et 60°C pour le gène de la GAPDH. L'analyse se fait sur un appareil ICycler (Biorad) et les prélèvements sont déposés en duplicat pour chaque concentration. La quantification par mesure de la fluorescence est réalisée au cours de la phase d'hybridation-élongation. |
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