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Tableau : Amplitudes de RDC observés par rapport à 1DNH

Cet histogramme permet également de valider les mesures de couplages dipolaires résiduels. En effet si un d’entre eux sort de la distribution, il est préférable de vérifier l’origine de cette valeur extrême (souvent une mauvaise estimation du couplage). Dans ce cas, il est préférable de le sortir des données afin d’éviter d’injecter une erreur expérimentale dans le calcul de structure.

Depuis 1997, l’étude des protéines dans les milieux orientant (bicelles lipidiques, bactériophages filamenteux, mélange de polyéthylène glycols) permet de mesurer les couplages dipolaires résiduels de manière systématique et précise qui donnent des informations orientationnelles à longue portée [cxx]. Ces derniers ont été utilisés pour différentes applications qui vont de l’affinement de structure à sa détermination ab initio [cxxi].

Les protéines paramagnétiques permettent aussi ce type de mesure à l’aide de paramètres tels que les couplages dipolaires résiduels [cxxii], le déplacement chimique paramagnétique [cxxiii] ou la corrélation Curie-dipolaire [cxxiv].
II.3.2.1.2-Les bactériophages filamenteux

Les phages filamenteux ont été introduits par Clore et al et Hansen et al simultanément en 1998 [cxxv, cxxvi]. Ils forment des cylindres de 2 µm de longueur et de 66 Å de diamètre et sont constitués d’un simple brin d’ADN de 7.4 kb entouré d’un gaine de 7620 sous-unités de protéines hélicales identiques de 46 acides aminées chacune. Ces hélices interagissent fortement avec l’ADN et font un angle de 15° avec l’axe du phage. La répétition régulière de ce motif entraîne une forte susceptibilité magnétique à l’origine de l’alignement des phages dans un champ magnétique élevé. Cet alignement se fait parallèlement au champ magnétique B0.

Les phages sont stables et posent peu de problème par rapport aux conditions expérimentales de l’échantillon. A pH supérieur à cinq ils sont chargés négativement [] et l’alignement induit est majoritairement de nature électrostatique. Des concentrations de sels importantes (~ 100 mM) peuvent être utilisées [cxxvii] pour limiter les interactions entre la protéine et les phages. Néanmoins, de trop fortes concentrations en sels entraînent leur agrégation. Le degré d’alignement obtenu dépend de la concentration de phages et peut être suivi par la mesure du dédoublement quadrupolaire du D2O.

III-MODÉLISATION MOLÉCULAIRE
III.1-Introduction

La modélisation moléculaire permet une description structurale et dynamique des molécules.

La chimie quantique est la théorie qui explique la liaison chimique et la réactivité chimique. Mais les calculs de mécanique quantique sont applicables seulement sur des systèmes de quelques dizaines d’atomes. La mécanique moléculaire, quant à elle, utilise la mécanique newtonienne pour approcher les structures des molécules. On va modifier les coordonnées des atomes afin d’avoir la conformation de la molécule à l’état d’énergie minimum (en fait, un cliché de la molécule dans des conditions statiques à 0°K). Le modèle représente les atomes dans les molécules par des « boules de mousse électrifiées et reliées par des ressorts ». L’ensemble des constantes de force et coefficients d’interactions pour les forces s’exerçant est appelé champ de force dont les paramètres sont basés sur des calculs de spectroscopies, de mécanique quantique et optimisés sur des structures connues. Pour trouver la géométrie optimum d’un ensemble d’atomes, il faut minimiser 3 coordonnées cartésiennes par atome (pour une protéine de 1000 atomes = 3000 coordonnées cartésiennes). Donc, il faut trouver le minimum d’une fonction (l’énergie) dans un espace à quelques milliers de variables. Toutes les méthodes d’optimisation connues ne peuvent trouver qu’un minimum local et on n’est jamais sur de trouver le minimum global de l’énergie pour une molécule. Il existe des méthodes (Monte-Carlo) qui permettent toutefois d’approcher ce minimum global en franchissant des barrières d’énergie intermédiaires.

La dynamique moléculaire : on sait que les structures ne sont pas figées aux températures auxquelles on veut les étudier. On va donc simuler le mouvement des atomes d'une molécule en intégrant les équations de Newton F = ma (F vecteur force, a : vecteur accélération). Pour un système de milliers d’atomes, toujours modélisés par des « boules de mousse en mouvement électrifiées et reliées par des ressorts », on calcule les forces sur chaque atome, puis leur accélération, et enfin leur vitesse, leurs nouvelles positions, et donc les nouvelles forces. Vu que les forces changent suivant les positions des atomes, il est nécessaire d’effectuer le calcul avec des pas d’intégration petits de l’ordre de la femtoseconde (10-15 seconde). Si on prenait des pas plus grands, la simulation serait plus fausse, car les forces auraient changé pendant le pas d’intégration, et ce changement n’aurait pas été pris en compte.

III.2-Le calcul de structure

Le calcul de structure devra satisfaire l'ensemble des contraintes expérimentales RMN tout en respectant les contraintes géométriques imposées par la nature des résidus qui composent la protéine. Ainsi la précision et l'exactitude de la structure calculée sont largement déterminées par la qualité de la liste des contraintes RMN. En effet la réduction de l’espace conformationnel, disponible pour la molécule, est due au nombre de contraintes (précision) alors que la consistance des données affectera l’exactitude de la structure. Il est alors nécessaire d'obtenir un maximum de contraintes dites longues portées (faisant intervenir des atomes de résidus éloignés dans la séquence peptidique) qui vont fortement contraindre la structure de la protéine. D'autre part les contraintes nOe, approximatives, ne permettent pas de définir des détails locaux de la structure. Si les contraintes d'angles dièdres, apportent une réponse satisfaisante à ce problème, les couplages dipolaires résiduels se montrent être un bon outil pour palier à ce manque.

Toutes les informations de distances et d’angles dièdres classiquement recueillis constituent une base de données qui servira à définir la position des N atomes de la protéine dans l’espace cartésien au cours du calcul de structure. Toutefois, même si l’ensemble des contraintes expérimentales est très complet, cette base est toujours sous déterminée (ne permet pas de définir de manière non ambiguë les 3N coordonnées des atomes de la protéine). Les informations expérimentales sont alors complétées par un champ de force qui décrit les propriétés géométriques des protéines en terme d’énergie potentielle d’interactions interatomiques liées ou non liées.


III.2.1-Le champ de force

Le champ de force AMBER, utilisé par le logiciel ARIA[cxxviii, cxxix, Error: Reference source not found] via le programme CNS[cxxx], est un champ de force semi-empirique, représenté par des termes d’énergie physiques décrivant des interactions atomiques entres atomes liés ou non liés.
- Energies potentielles d’interactions liées

Les énergies potentielles liées représentent les énergies correspondant aux déformations de la longueur de liaison, de l’angle entre les liaisons et des angles dièdres de torsion. Leurs expressions sont :


Nature d’interaction

Expression du potentiel

Longueur de laison covalente

E
l

l
liaison = 1/2∑k(l-l0)2

Angles de laison

E
θ

θ
angle= 1/2∑k(θ-θ0)2

Angles propres de torsion

E
Ψ

Ψ
propre= 1/2∑k(Ψ-Ψ0)2

Angles impropres de torsion

E
Φ

Φ
impropre= 1/2∑k(Φ-Φ0)2


Légende : l représente la longueur des liaisons covalentes reliant les atomes A-B, θ représente l’angle défini par les vecteurs A-B et B-C, Ψ et Φ sont des angles de torsion définis par les plans ABC et BCD. l0, θ0, Ψ0 et Φ0 sont les valeurs de chacune des grandeurs à l’équilibre. Les ki (i = l, θ, Ψ ou Φ) sont les constantes de force de chaque force de potentiel.
- Energies potentielles d’interactions non liées

Les énergies non liées entre les atomes du système moléculaire peuvent être simulées par deux potentiels différents. Dans un premier temps (au cours du calcul) le potentiel sera défini uniquement à partir de l’interaction de Van der Waals, on parle alors de potentiel quartique. Puis, dans un second temps (souvent dans la phase de raffinement du calcul) on ajoute la contribution coulombienne qui forme l’interaction électrostatique du potentiel.

Enon-liée = E van der Waals + E électrostatique
- La fonction énergie cible

Le principe du calcul de structures de macromolécules sous contraintes est de minimiser une fonction d’énergie cible composée de termes issus du champ de force et d’un terme expérimental.

Ecible = Eliée + Enon-liée + E exp.

avec E exp = EnOe+ ERDC où EnOe est l’énergie des contraintes nOe et ERDC l’energie des contraintes orientationnelles.

L’énergie expérimentale se décompose en une somme de termes qui correspondent chacun à un type de mesure structurale. Le terme le plus important en RMN est celui des nOe. Les distances sont dérivées du volume des pics nOe à partir de la relation D ~ V-1/6 convertit le volume mesuré en une distance. Pratiquement on introduit des limites de distances basse et haute, L (lower) et U (upper) avec

L = max (0, D-) et U = D + 

pour contenir la distance à un intervalle plutôt qu’à une valeur unique. Les contraintes de distances déduites des nOe sont introduites sous forme d’un potentiel harmonique lorsque la distance est proche de la borne inférieure (L) ou supérieur (U) et linéaire lorsqu’on s’en éloigne. La linéarité du potentiel pour de grandes violations permet de ne pas introduire d’énergie trop importante dans le calcul ce qui serait le cas si le potentiel harmonique était conservé. Lorsque la distance interproton est comprise entre [L, D] aucune force n’est appliquée aux atomes.

Les contraintes d’angles dièdres sont également exprimés sous la forme d’un potentiel harmonique.

kpropre(Ψ-Ψmin)2 pour Ψ  Ψmin

E
Ψ
propre=∑ 0 pour Ψmin  Ψ  Ψmax


kpropre(Ψ-Ψmax)2 pour Ψ  Ψmax
Le traitement des contraintes orientationnelles déterminées à partir des couplages dipolaires résiduels est plus compliqué. En effet, comme nous l’avons déjà vu précédemment, il est nécessaire de définir le tenseur d’alignement de la molécule, qui n’est pas connu a priori. Les RDCs sont incorporés au calcul de structure par l’intermédiaire d’un terme d’énergie empirique [tjandra/p96cxxxi] qui est ajouté aux autres termes conventionnels et qui est de la forme

ERDC = krdc(RDCcal – RDCobs)2

krdc est la force de constante et RDCcal etRDCobs sont les valeurs calculées et mesurées des couplages dipolaires résiduels respectivement. Le tenseur d’alignement est considéré comme un repère qui est représenté par une pseudo-molécule localisée dans les environs de la protéine. Cette pseudo-molécule consiste à quatre atomes équidistants (OXYZ). L’un, représente l’origine du repère et les trois autres représentent les trois axes OX, OY, et OZ qui sont orthogonaux les uns par rapport aux autres. ERDC est évalué en calculant les angles que forme le vecteur considéré avec le tenseur. Durant le processus de calcul, la pseudo-molécule est continuellement réorientée pour permettre la meilleure corrélation entre le couplage dipolaire observé et calculé.

III.2.2-Méthode de calcul – ARIA1.2

Traditionnellement, la mesure des nOe sert de source primaire pour l’information structurale. ARIA est un logiciel de calcul qui permet d’attribuer les contraintes nOe et de gérer les ambiguïtés d’attribution. Les ambiguïtés sont obtenues au cours de l’attribution initiale du calcul, à partir d’une liste de contributions possibles pour chaque pic nOe. L’ambiguïté est levée durant le calcul de structure.
- ARIA1.2

Aria1.2 effectue un calcul itératif (9 itérations par défaut).Pour chaque itération, on utilise les structures de plus basses énergies du calcul précédent. En fait le protocole d’ARIA repose sur la notion de contrainte structurale ambiguë. Cette approche considère tous les candidats pouvant contribuer à l’intensité du pic de corrélation. Au cours du calcul de dynamique moléculaire, la contribution de chaque candidat est évaluée d’après les distances dans le modèle moléculaire déjà calculé. On peut imaginer deux boules reliées par un ressort et qui sont susceptibles de contribuer à la corrélation. Si leur distance par rapport au modèle est dans la limite [L,U], ARIA ne mettra aucune force pour modifier leur distance. Dans le cas où leur distance est hors limite alors l’énergie qui sera donnée à cette contrainte dépendra de la valeur de la distance. Pour une distance trop éloignée ARIA aura tendance à donner une énergie moins grande à cette contrainte (ressort moins fort donc une constante de force plus faible) alors que pour une distance plus proche ARIA donnera plus d’énergie (ressort plus fort donc constante de force plus importante) à cette contrainte qui « tirera » la structure au niveau des deux atomes. Une contrainte ambiguë est satisfaite si au moins un des candidats est compatible selon le modèle.

Comme l’information structurale contenue dans une contrainte ambiguë est plus faible que celle contenue dans une contrainte non-ambiguë, les candidats ayant les plus petites contributions sont progressivement identifiés et éliminés au cours des itérations successives. Toutefois, la combinaison de contraintes ambiguës peut aider à orienter le calcul vers la bonne structure.

ARIA traite indifféremment les pics de corrélation nOe explicites (attribués manuellement) ou implicites (définis seulement par les déplacements chimiques) et chaque itération utilise la même liste de pics de corrélation. Seules les structures (de plus basse énergie) sont héritées de l’itération précédente et affectent les étapes de calibration et d’attributions des pics.

Au début de chaque itération, chaque spectre est calibré indépendamment. Un spectre nOe est rétro-calculé à partir des meilleurs structures de l’itération précédente et comparé au spectre expérimental afin de déterminer des constantes de calibrations (par types d’atomes). Les volumes expérimentaux sont alors traduits en contraintes de distances. Les meilleures structures de l’itération précédente sont à nouveau analysées pour déterminer les contraintes violées systématiquement. Les bornes de contraintes violées sont ensuite élargies à l’intervalle [0,6] Å et les contraintes toujours violées sont éliminées. Les violations sont définies par deux seuils de tolérance (en distance et en proportion sur l’ensemble structural) qui peuvent être paramétrés par l’utilisateur (paramètres violtoler et violratio).

L’étape suivante est l’attribution partielle des contraintes ambiguës. Les contraintes acceptées à ce stade sont analysées au regard des meilleures structures de l’itération précédente afin de déterminer la contribution de chaque paire de protons à l’intensité du pic de corrélation. Seules les contributions majoritaires sont conservées. Le paramètre ambigcutoff détermine la proportion des contributions conservées.

Après les étapes de calibration et d’attribution, les contraintes des différents spectres NOESY-HSQC sont écrites dans le répertoire de l’itération puis rassemblées (en éliminant les redondances) avant d’être intégrées aux contraintes (angles dièdres, liaisons hydrogènes, RDC) dans un calcul de dynamique moléculaire soit à partir des meilleures structures de l’itération précédente soit à partir de structure aléatoire. Les nouvelles structures serviront de base à l’itération suivante.
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