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II.2.2-Attribution des chaînes latérales
Les quatre expériences 3D les plus utilisées pour l’attribution des chaînes latérales des acides aminés d’une protéine doublement marquée 13C/15N font intervenir un transfert 13C-TOCSY pour permettre le transfert de l’aimantation le long des chaînes.

Les deux premières sont de type 3D-HC(CACO)NH-TOCSY [ci,cii,ciii] et consistent, après excitation des protons aliphatiques, à relayer l’aimantation, via une étape de 13C-TOCSY, jusqu’au C puis à transférer à l’azote 15N et au proton HN du résidu suivant. La séquence 3D-H(CCACO)HN-TOCSY permet d’éditer les fréquences 1H et on obtient des pics de corrélation (HiCC ; Ni+1 ; HNi+1). La séquence 3D-(H)C(CACO)HN-TOCSY permet d’identifier les carbones de chaînes latérales et on obtient les pics de corrélation (Ci, ; Ni+1 ; HNi+1) (Figure 11).

Après avoir identifié les différents carbones et protons constituant la chaîne latérale d’un acide aminé, il reste à savoir quel proton est associé avec quel carbone. Deux expériences de type HCCH-TOCSY [civ,cv] permettent cette attribution. Dans un spectre 3D-(H)CCH-TOCSY on obtient des pics de corrélation entre les noyaux (Ci, ; Ci, ; HiCC) et dans un spectre 3D-H(C)CH-TOCSY les pics corrélés correspondent aux noyaux (HiCCβ… ; Ci,… ; HiCC) (Figure11).

Le nombre important de transfert d’aimantation le long des chaînes latérales dans ces types de séquences limite leurs applications à des protéines de masse inférieure à 20kDa. Ces expériences ne peuvent pas être appliquées aux protéines fortement deutérées qui ne possèdent pas une forte concentration en protons aliphatiques car le transfert de cohérence part du proton qui est détecté.




Figure 11 : Exemples d’expériences triple résonance pour l’attribution des chaînes latérales d’une protéine marquée 15N et 13C.


Toutefois des expériences ont été développées pour l’attribution des chaînes latérales de protéines partiellement deutérées [Error: Reference source not found]. Pour les protéines fortement deutérées, l’attribution des carbones des chaînes latérales peut se faire à l’aide de la séquence C(CACO)NH, équivalente à la séquence (H)C(CACO)NH précédemment décrite, mais au lieu de commencer par exciter les protons aliphatiques, ce sont les carbones aliphatiques qui sont polarisés au départ [cvi].


II.3-Recueil des contraintes structurales
II.3.1-Les contraintes mesurables classiques

L’étude structurale classique est basée sur la mesure d’un maximum de contraintes locales semi-quantitatives. Ces contraintes géométriques, des distances entre atomes et des angles dièdres entre liaisons, sont issues des trois observables RMN : la relaxation dipolaire, le couplage scalaire et le déplacement chimique.

-Contraintes de distances:nOe

La principale contrainte structurale utilisée en RMN des protéines est la distance r entre des paires de protons, proches dans l’espace (Figure 12).



nOe (1/r6)

Figure 12 : Contrainte de distance mesurée par effet nOe
Cette information est mesurable grâce à la propriété de transfert d’aimantation longitudinale entre spins à travers l’espace, appelée la relaxation croisée ou l’effet Overhauser nucléaire (nOe = nuclear Overhauser effect). Cet effet nOe apparaît lorsque les deux noyaux sont assez proches dans l'espace (< 6Å de distance) pour se transmettre de l'énergie par une interaction de type dipôle-dipôle. Cet effet de relaxation croisée est mesurable par RMN à l’aide de séquences de type NOESY [cvii]. La force de l'interaction nOe est déterminée par l'intégration du pic de corrélation résultant de l'échange d’aimantation entre deux spins en interaction dipolaire. Pour la mesure des volumes des corrélations nOe, on utilise un temps de mélange court afin d'être dans des conditions où le volume de chacune d'entre elles est directement relié à la distance intermoléculaire telle que:

Iij  1/ r6ij

On néglige ainsi la diffusion de spin qui implique que le volume nOe soit une fonction complexe de plusieurs distances intermoléculaires. Théoriquement, si une distance interatomique rref est connue, alors en l’absence de mouvements internes locaux, les autres distances rij peuvent être déterminées par la relation :

rij= rref (Iref/Iij)

où Iref et Iij sont les intégrales des pics de corrélation. En pratique, les temps de mélange sont toujours trop longs et les distances issues des nOe ne sont pas définies de manières exactes à cause de différents effets non désirables tels que la dynamique locale ou la diffusion de spin qui peuvent biaiser les mesures. Par conséquence, la relation entre volume nOe et distance intermoléculaire est inévitablement approximative. C'est pourquoi, on ne peut exprimer une distance dérivée d'un effet nOe que dans une gamme de distances permises plutôt que par une distance spécifique. Nous reviendrons sur cette problématique au moment de calcul de structure de SufA.

Notons qu'il est difficile d'attribuer tous les pics de corrélations nOe car ils peuvent correspondre à des résonances accidentellement dégénérées ainsi qu’à de résonances non attribuées, générant des ambiguïtés. Pour lever ces dernières, la stratégie classique est de calculer un jeu de structure préliminaire de basse résolution en utilisant uniquement les pics de corrélations nOe attribués de façon non ambiguë, et ensuite d'utiliser ces structures comme structure de base pour de nouveaux calculs qui devraient permettrent de faciliter l’analyse et l’attribution des pics de corrélation nOe restants. Un certain nombre de processus d'attribution semi-automatique des contacts nOe ont été proposées (AutoStructure [cviii]) mais d'autres approches telle que ARIA [cix], basées sur l'utilisation de ces contraintes ambiguës, se sont développées ces dernières années.
-Les angles dièdres:

Les angles dièdres, formés entre deux noyaux reliés par trois liaisons covalentes, constituent un deuxième type de contraintes qui définissent la conformation que peut prendre la chaîne polypeptidique. En effet, la chaîne principale d’une protéine est une suite de plans peptidiques qui s’articulent les uns par rapport aux autres au niveau de leurs liaisons N-C et C-C’ (ou de leurs angles respectivement  et ) (Figure 13). De même, l’orientation d’une chaîne latérale d’un acide aminé peut être décrite par ses angles dièdres 1, 2, …définis au niveau des liaisons C-C, C-C,…



Figure 13 : Représentation des angles Φ et ψ entre deux résidus
Le paramètre RMN qui contient l’information des angles dièdres d’une protéine est la constante de couplage scalaire homonucléaire ou hétéronucléaire 3J. Ce couplage entre deux noyaux séparés par trois liaisons covalentes est une fonction de l’angle dièdre θ suivant l’équation de Karplus [cx] :

3J = A cos2  + B cos  + C

où A, B et C dépendent des noyaux impliqués dans les liaisons et ont été déterminés empiriquement. Les couplages les plus mesurés sont 3JHNH, 3JHN et 3JHH et dépendent respectivement des angles ,  et 1.Toutefois, l’allure des courbes de Karplus montre qu’à une constante mesurée peut correspondre jusqu’à quatre valeurs d’angles dièdres. Ce paramètre est donc dégénéré.

Cette information peut être complétée par des mesures de couplages scalaires inter-résidus 3HJNCO à travers les liaisons hydrgènes N-H•••O=C. En effet, les éléments de structure secondaire sont stabilisés par un réseau régulier de liaisons hydrogènes dont l’identification expérimentale par ce paramètre, bien qu’il ne soit pas toujours très facile à mesurer (expériences peu sensibles à cause de la faible valeur de la constante de couplage, environ 0.3 Hz, pouvant nécessiter des délais longs dans la séquence d’acquisition) confirme leur présence et permet de les contraindre pendant le calcul de structure. [cxi,cxii].

-Le déplacement chimique :

Enfin, le déplacement chimique des atomes de la chaîne principale et du début de la chaîne latérale est extrêmement sensible aux conformations locales [cxiii]. A partir de ces valeurs, il est possible d’identifier avec une bonne précision les régions de structure secondaire d’une protéine, soit en calculant un index de déplacement chimique (CSI = chemical shift index) par rapport à une valeur standard par résidu mesurée dans des pelotes statistiques [cxiv,cxv], soit en calculant, à partir d’une base de données, les angles dièdres  et  de la protéine à l’aide par exemple du programme TALOS [cxvi]. Ce logiciel se base sur une prédiction empirique des angles de torsions  et  en utilisant les combinaisons des cinq types de déplacement chimique (H, C, C, CO, N) et les structures d'une vingtaine de protéines qui constituent sa base de données. En pratique, TALOS compare les déplacements chimiques et la séquence en acides aminés d'un triplet de résidus issus de la base de données à celle d'un triplet issu de la protéine. De cette comparaison, TALOS garde les 10 meilleurs résultats pour le résidu central de ce triplet. Ensuite, le programme donne en sortie les valeurs  et  du résidu central (en fait des valeurs moyennes et leurs déviations standards). Si les valeurs  et  sont en désaccord, TALOS ne fait pas de prédiction pour le résidu central.

II.3.2-Les contraintes orientationnelles

Si l’approche classique de la RMN, basée essentiellement sur la détermination de contraintes locales, est très performante pour l’étude de protéines globulaires ou compactes, une information à plus longue portée peut parfois faire défaut. C’est notamment le cas lors d’études de protéines deutérées (qui ont peu de protons), multidomaines (pour lesquelles un jeu de distance inter-module est trop souvent limité pour pouvoir définir leurs positions relatives) ou de formes allongées (dont la géométrie spécifique ne permet pas de mesurer assez de nOe). Pour toutes ces molécules, une structure 3D haute résolution ne peut être obtenue à partir des seules contraintes de distances de type nOe. C’est pourquoi le développement d’une nouvelle approche, basée sur l’obtention de contraintes orientationnelles et à longue portée, a suscité un grand intérêt ces dernières années. Ces contraintes sont appelées orientationnelles parce qu’elles dépendent de l’orientation d’un vecteur de la molécule étudiée (par exemple le vecteur N-HN) par rapport au champ magnétique statique. Chaque vecteur aura donc une orientation propre qu’on cherche à déterminer.
Pour notre part nous avons mesuré des couplages dipolaires résiduels (RDC residual dipolar coupling) dans un milieu orientant nous permettant d’obtenir un jeu de contraintes supplémentaires qui est injecté dans le calcul de structure au même titre que les autres contraintes. Ces contraintes orientationnelles nous donnent par contre une information locale, en terme de structure que les contraintes de distances de type nOe ne permettent pas d’obtenir. Par conséquent nous les avons utilisé pour l’affinement de la structure.

II.3.2.1- Interaction dipolaire
II.3.2.1.1- Aspect théorique

Le spin nucléaire génère un champ magnétique autour de lui dans la direction de son moment magnétique qui peut interagir avec un second spin nucléaire qui possède lui-même son propre champ magnétique local. Le couplage dipolaire est l’interaction mutuelle de ces deux dipôles magnétiques qui pour deux spins I et S a un Hamiltonien de la forme (1), considérant que seule la composante longitudinale z (donc parallèle à B0) du champ magnétique local du spin Ii sur le spin Ij est significative

HDij = - γIγSμ0h / 8π2 Iz Sz [(3cos2θ(t) -1)/2r3(t)] (1)

γi γj sont les rapports gyromagnétiques des spins considérés, r leur distance relative et θ l’angle entre vecteur r qui relie les deux spins, et le champ magnétique statique B0. On observe donc un couplage Dij

Dij = - γIγSμ0h / 8π2 <3cos2θ(t)/2r3(t)> (2)

Si on considère d’autre part que les couplages sont mesurés dans une molécule supposée rigide, alors les distances r restent constantes, et on peut exprimer Dij de la manière suivante :

DIS = DISmax ½ <3cos2θ - 1> avec DISmax = - γIγSμ0h / 8π2 (3)

Ainsi la valeur du couplage dipolaire dépend de l’orientation du vecteur r par rapport au champ statique, orientation pondérée par sa probabilité d’être dans l’orientation θ. Dans un milieu isotrope, où toutes les orientations sont possibles et équiprobables, le couplage dipolaire résiduel est moyenné à 0. Par contre dans un milieu anisotrope tel que les cristaux liquides, l’orientation préférentielle entraîne une moyenne non nulle des termes de couplage dipolaire. Cette approche repose sur la description de l’orientation de la molécule par un tenseur d’alignement (de trace nulle) qui décrit la distribution des orientations des molécules dans le milieu anisotrope. Clore et al [cxvii] ont montré que la constante de couplage Dij peut être simplifiée en la relation suivante

DIS (θ, φ) = DaIS {(3cos2θ - 1) + 3/2 R (sin2 θcos2φ)} (4)

DaIS et DrIS sont les composantes axiale et rhombique du tenseur D données par : DaIS = 1/3[DzzIS - (DxxIS + DyyIS)/2] et DrIS = 1/3[DxxIS - DyyIS). R est le rhombicité définie par DrIS / DaIS et est toujours positive ; θ est l’angle entre le vecteur interatomique r et l’axe z du tenseur ; φ est l’angle de la projection du vecteur interatomique r dans le plan (x,y) relativement à l’axe x. Daij inclus différentes constantes tels les rapports gyromagnétiques des deux noyaux γI et γS, l’inverse de la distance entre les deux noyaux au cube <r-3(t)> moyennée dans le temps et le paramètre d’ordre général S pour les fluctuations angulaires du vecteur internucléaire. L’expression (4) montre que la valeur du couplage dipolaire va dépendre de l’orientation du vecteur interatomique r dans le référentiel du tenseur d’alignement D. De ce fait, la valeur du couplage dipolaire permettra donc d’obtenir des informations concernant l’orientation des différents vecteurs de la protéine par rapport à ce référentiel. Cependant, le couplage dipolaire résiduel est dégénéré. La détermination de l’orientation de vecteur sera par conséquent obtenue à partir de la mesure du couplage dans au moins deux milieux orientant. L’alignement de la molécule dans le deuxième milieu, permet d’obtenir deux jeux de données avec des tenseurs d’alignements différents, qui vont permettre de lever la dégénérescence. Pour l’analyse de SufA, nous avons utilisé un seul milieu parce que nous voulions utiliser les RDC uniquement au cours du calcul de structure pour l’affinement, donc à partir d’une structure connue dont on a déterminé les composantes du tenseur.

Afin de pouvoir utiliser les RDC pour l’affinement de la structure de la protéine, les composantes axiale et rhombique du tenseur d’alignement doivent être connu. La méthode la plus efficace pour déterminer les éléments du tenseur d’alignement est la décomposition en valeurs singulières [cxviii]. Il y a cinq éléments indépendants dans le tenseur d’alignement. Ils correspondent aux composantes axiale et rhombique et son orientation, définie par les trois angles d’Euler qui caractérisent la rotation du repère du tenseur d’alignement par rapport au champ magnétique statique. Pour déterminer ce tenseur, il est nécessaire que le nombre de RDC soit plus grand que le nombre d’éléments à calculer. C’est le cas d’une protéine où ce nombre est bien supérieur à cinq.

Le programme MODULE [cxix] développé au laboratoire RMN de l’IBS permet de déterminer le tenseur d’alignement via les RDC mesurés pour des molécules partiellement orientées en optimisant les paramètres du tenseur par une régression non linéaire utilisant un recuit simulé.

Clore et al [Error: Reference source not found] propose une approche qui consiste à se servir de l’histogramme de l’ensemble des couplages dipolaires résiduels normalisés. Si la distribution des vecteurs internucléaires est uniforme, un tel histogramme ressemble à un spectre de poudre observé pour l’anisotropie du déplacement chimique en RMN à l’état solide. En effet, dans un histogramme composé de plusieurs types de RDCs (1DNH, 1DCON, 2DCOHN par exemple) les vecteurs ont des orientations différentes et donc échantillonnent presque tout l’espace, quasiment comme dans un spectre de poudre. Les points singuliers de l’histogramme correspondent aux valeurs propres du tenseur d’alignement Dxx, Dyy et Dzz. Pour tracer ce type d’histogramme, il est nécessaire de normaliser tous les couplages dipolaires résiduels mesurés (DIS) par rapport aux couplages dipolaires résiduels 1DNH par exemple, car leur gamme de couplage est plus étendue. On obtient le couplage dipolaire résiduel normalisé par rapport NH (DISnorm/NH) à partir du couplage dipolaire résiduel mesuré de la manière suivante :

DISnorm/NH = DIS (r3IS / γIγS)( γNγH / r3NH) (5)

Les facteurs d’échelles optimum empiriquement déterminés par Bax et al sont présentés dans le tableau suivant.

RDC mesuré

Distance internucléaire effective (Å)

Facteur de normalisation

par rapport à NH

1DNH

1.04

1

2DCOHN

2.05

0.300

1DCON

1.33

0.120
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