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I.2.5-La spectroscopie TROSY
Les expériences qui corrèlent exclusivement les 1HN, 15N et 13C, ont donc été améliorées par la deutération, des 13CHn, qui produit l’élimination de la relaxation dipolaire du 13C par le proton directement lié et qui permet la réduction de la largeur spectrale des 1HN due au couplage dipôle-dipôle (DD) avec les protons dans l’espace environnant. Cependant, comme relaté avant, la deutération imposent certaines limites à la collecte d’informations structurales qui peuvent être obtenues par RMN.

C’est pourquoi, pour l’étude des protéines de grande taille, il a été développé l’expérience TROSY (Transverse Relaxation Optimised Spectroscopy ) qui permet la sélection d’une seule des quatre corrélations issue du couplage JNH. Ces corrélations résultent de l’interaction constructive ou destructive des deux phénomènes de relaxation transversale que sont le couplage DD et le CSA (chemical shift anisotry) et qui ont un effet comparable à haut champ sur la relaxation [lxxxii]. Sur la Figure 5, on peut voir la différence d’information RMN entre une expérience HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) qui ne laisse apparaître qu’un seul pic à (ΩN, ΩH) suite au découplage du 15N et du HN et une expérience TROSY, dérivée de l’expérience HSQC.



ΩN

F
ΩH

ΩH
igure 5 : Comparaison des largeurs de raies de résonances d’un spectre [15N-1H] HSQC et d’un spectre [15N-1H] TROSY [lxxxiii]
Notons que ce phénomène n’est mesurable que sur les raies N-H amides (pour lesquels le maximum de cette contribution se produit à une fréquence de 1 GHz) et N-H aromatiques. D’autre part l’édition sélective de l’une des raies dans la séquence TROSY peut induire une perte d’intensité par rapport à une séquence HSQC. En revanche, sur un échantillon deutéré l’expérience TROSY apporte un gain en résolution et en sensibilité.

L’ensemble de ces développements permettent maintenant l’étude structurale de protéine dont la tailles se situe aux alentours de 25-30 kDA, même si, comme nous l’avons déjà cité, quelques records de résolution de structures ont été enregistrés sur des oligomères symétriques.

I
I-ETAPES DE L’ÉTUDE PAR RMN DE PROTÉINE DE GRANDE TAILLE


Figure 6 : Les différentes étapes d’une étude par RMN

L’approche expérimentale adoptée pour la caractérisation structurale et dynamique d’une protéine par RMN diffère suivant sa taille. La figure 6 schématise les différentes étapes de l’étude d’une protéine de grande taille à l’échelle RMN, c'est à dire de plus de 20 kDa enrichie en 13C et 15N.

II.1-Expression de protéines recombinantes et marquées pour la RMN

La méthode la plus simple pour isoler la protéine étudiée est d’utiliser la cellule qui la produit naturellement. La RMN multidimensionnelle nécessite cependant des quantités importantes de matériel, quelques dizaines de milligrammes par échantillon, ce qui rend le travail de purification très lourd si la protéine n’est pas extrêmement abondante. La purification à partir de systèmes surproducteurs construits à partir du gène cloné est en général beaucoup plus aisée. Elle permet l’expression dans des micro-organismes (E. coli, levure) dont la croissance est rapide et les conditions de culture maîtrisées (division cellulaire toutes les 20 min à 37°C). De plus cette approche rend accessible le marquage isotopique (15N, 13C, 2H) uniforme ou sélectif. En effet l’utilisation d’organismes telle la bactérie E coli, facilement modifiée d’un point de vue génétique et adaptable, permet d’effectuer assez aisément les différents types de marquage. Cette étape de surexpression doit toutefois faire l’objet d’une évaluation minutieuse du meilleur système d’expression afin d’optimiser le rendement de production de la protéine et de minimiser son coût.

II.1.1-Optimisation d’un système d’expression
Un système d’expression est optimal quand il permet la production d’une protéine recombinante pure, fonctionnelle et en quantité suffisante. Cela nécessite une adéquation totale entre le gène d’intérêt, l’organisme producteur, le vecteur d’expression, le milieu de production et les conditions de culture.

Le gène est une séquence d’ADN contenant l’information nécessaire à l’expression d’une protéine donnée. Il est obtenu à partir de l’ADN d’un organisme, puis après avoir été amplifié en quantité suffisante par PCR, il est introduit dans un vecteur d’expression ou plasmide. Ce dernier est un double brin d’ADN circulaire pouvant se répliquer de façon autonome dans l’organisme hôte et qui utilise la machinerie de la cellule hôte pour synthétiser la protéine d’intérêt.

Les systèmes d’expression existant aujourd’hui sont très nombreux et utilisent des stratégies diverses. Le plus souvent, E. coli est l’hôte de choix car c’est un organisme bien caractérisé, dont il existe de nombreux mutants (qui permettent d’amplifier ou inhiber une fonction biologique), et pour lequel un grand nombre de vecteurs, souvent commerciaux, ont été développés. On optimise la quantité de protéine produite en mettant le gène sous le contrôle d’un promoteur de transcription fort, c'est-à-dire capable d’induire la production de la protéine recombinante à une concentration de 10 à 30 % supérieure à celle de la totalité des protéines cellulaires. En assurant, d’autre part, un démarrage de traduction efficace pour éviter une fuite transcriptionnelle (expression de gène avant l’induction). En ce qui concerne le promoteur, on peut faire appel à système constitutif, c'est à dire non régulé, soit à un système inductible qui déclenche l’expression lorsqu’un stimulus extérieur est donné. Ces systèmes inductibles sont particulièrement intéressants pour exprimer des protéines toxiques pour l’hôte. ; ils sont cependant délicats à utiliser car il faut déterminer, pour chaque cas, quel est le moment idéal pour déclencher l’expression.

Un autre aspect à prendre en considération est le choix du compartiment cellulaire dans lequel il est souhaité que la protéine soit exportée. Pour une sécrétion dans le cytoplasme ou dans le milieu extracellulaire, la présence d’une séquence signal sur le vecteur est requis en amont du gène d’intérêt.

Enfin, le plasmide peut contenir des « tags »d’affinité ou des protéines de fusion soit pour faciliter la purification (« tag » 6-histidines) ou la détection de protéine recombinante, soit pour prévenir la formation de corps d’inclusion en améliorant la stabilité et la solubilité (donc l’expression) des petites protéines (protéines Glutathion-S-transférase[lxxxiv], ubiquitine [lxxxv]).Sous condition de la présence de site de clivage spécifique, ces protéines de fusion peuvent être enlevées pendant les étapes de purification de la protéine d’intérêt.

II.1.2-Le milieu de production

Afin de réduire les coûts de production, les protéines marquées sont produites en volume réduit de 1 ou 2 litres en général de milieu dit minimum dans lequel les sources en azote et/ou carbone sont contrôlées et marquées isotopiquement 15N et/ou 13C. Différents milieux ont été décrits dans la littérature qui vont du plus simple , le milieu M9 (comportant les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne et dont la composition est donnée dans le chapitre matériels et méthodes)[lxxxvi], à d’autres milieux plus complets contenant des vitamines ou des oligo-éléments [lxxxvii,lxxxviii]. Dans certains cas, il peut être nécessaire d’utiliser un milieu riche provenant d’algues marquées partiellement hydrolysées [lxxxix].

II.1.3-Les techniques de marquage isotopique

Le type de marquage isotopique dépend principalement de la taille de la protéine étudiée. En dessous de 10 kDa, la RMN du proton (expériences homonucléaires) suffit pour l’étude de la protéine. Entre 10 kDa et 15 kDa, un simple marquage 15N permet d’améliorer la résolution spectrale. Entre 15 et 20 kDa, un double marquage 15N/13C s’impose. Enfin, pour l’étude d’une protéine de plus de 20 kDa, un triple marquage est souvent requis.

D’un point de vue expérimental, le marquage isotopique d’une protéine chez E. coli est réalisé en utilisant du 15N-chlorure d’ammonium et/ou du 13C6-glucose dans le milieu minimum M9. La deutération est effectuée en dissolvant les différents composant du milieu dans de l’eau lourde (D2O) stérile. L’eau lourde affectant négativement le métabolisme de la cellule (modification des longueurs des liaisons hydrogènes, des vitesses de réactions,…) [xc], son incorporation entraîne donc une diminution de la croissance cellulaire qui peut affecter le rendement de production de la protéine d’intérêt.

Le marquage spécifique peut se pratiquer à partir d’acides aminés marqués disponibles commercialement. Un protocole a été décrit pour obtenir à moindre coût des protéines deutérées et marquées uniformément 15N/13C et spécifiquement 1H sur les groupes méthyles des chaînes latérales [Error: Reference source not found].

II.1.4-Préparation de l’échantillon RMN

La purification des protéines est un sujet vaste et dépasse largement le cadre de cette thèse. Elle s’effectue en plusieurs étapes qui vont de l’extraction de la protéine d’intérêt de l’organisme hôte (casse cellulaire, précipitation de l’ADN, centrifugation,…), à sa mise en solution et purification en utilisant différentes techniques chromatographiques (chromatographie d’exclusion, d’échange d’ion, d’interaction hydrophobe ou d’affinité) qui ont pour but d’isoler la protéine d’intérêt du reste des biomolécules qui sont restées en solution. Pour la RMN, le degré de pureté final n’est pas critique, une préparation homogène à 85-90 % sur gel de polyacrylamide SDS est probablement suffisante, à condition qu’il ne reste pas de contaminant majoritaire dépassant 3 à 4 %. Il est toutefois souhaitable d’avoir une pureté la plus élevée, afin de réduire les traces de protéases susceptibles de dégrader l’échantillon. La protéine est ensuite concentrée (par dialyse, ultrafiltration, chromatographie sur gel) en présence du tampon d’étude. Le tampon phosphate est souvent utilisé car, ne contenant pas de proton, il n’interfère pas avec l’enregistrement des spectres 1H des protéines non marquées. Actuellement des tampons tels que TRIS, HEPES, MES sont disponibles sous forme perdeutérées. Il est d’autre part nécessaire d’optimiser les conditions de tampon et de pH pour répondre à celles imposées par la RMN tout en s’assurant que la protéine reste stable pendant plusieurs semaines.

La concentration minimale finale exigée pour une étude structurale est 0.5 mM dans un volume minimale de 450 L (300 L pour des tubes spéciaux). Afin d’éviter une dégradation de la protéine par des micro-organismes contaminants, la solution finale peut être stérilisée par filtration ou des faibles quantités d’antibiotiques et/ou d’azoture peuvent être ajoutéés. Il est souvent nécessaire d’ajouter des inhibiteurs de protéases et enfin, le scellement de tube RMN sous un gaz inerte tel que l’argon, peut limiter les dommages oxydatifs causés dans le temps, par exemple sur les résidus méthionines et cystéines ainsi que tout développement bactérien.

II.2-Attribution des raies de résonances d’une protéine marquée
Une fois obtenu un échantillon de protéine pur, concentré et stable, l’enregistrement des spectres RMN peut être effectué. Toutefois l’extraction des informations structurales et dynamiques n’est pas possible à ce stade de l’étude. Avant cela, il est impératif de connaître les déplacements chimiques de chacun des atomes de la protéine. Pour effectuer cette étape d’attribution des raies de résonances, trois types d’informations sont utilisées : les interactions à travers les liaisons (via les couplages scalaires 1J,2J), les interactions à travers l’espace (via les couplages dipolaires) et l’environnement chimique (via les déplacements chimiques des atomes). La stratégie à employer pour l’attribution des raies de résonances va dépendre du type de marquage isotopique de l’échantillon. Dans le cas d’une protéine non marquée ou marquée uniquement à l’azote 15, la stratégie classique a été détaillée dans l’ouvrage de Wüthrich [xci]. Dans le cas des protéines doublement ou triplement marquées, la méthode repose sur la combinaison d’expériences hétéronucléaires tridimensionnelles (3D) ou quadridimensionnelles (4D) qui corrèlent 2 ou 3 types de noyaux différents par le moyen des couplages scalaires. Le principe du spectre 3D est schématisé sur la Figure 7 : L’idée est de lever l’ambiguïté au niveau de deux pics de corrélation dans un plan en ajoutant une troisième dimension qui devrait permettre de les séparer.




Figure 7 : Principe d’une expérience 3D
L’attribution de tous les noyaux observables par RMN d’une protéine doublement ou triplement marquée se fait en deux étapes : la première consiste en l’attribution de la chaîne principale et des carbones , la seconde en l’attribution des chaînes latérales.

II.2.1-Attribution de la chaîne principale et des C

Les expériences 3D triple résonance utilisées classiquement pour l’attribution de la chaîne polypeptidique d’une protéine doublement marquée sont toutes basées sur le même principe : la corrélation de l’azote et du proton d’un résidu i avec un troisième atome , un carbone dans la plupart des cas, du même résidu ou du résidu précédent [Error: Reference source not found,xcii]. Ces corrélations, dépendant du chemin de transfert de cohérence sélectionné, se font par le transfert successif de l’aimantation à travers 2, 3 voire 4 liaisons covalentes via des couplages scalaires 1J,2J relativement élevés (figure 8).



Figure 8 : valeurs des constantes de couplages 1J et 2J utilisées pour le transfert d’aimantation dans les protéines marquées 15N et 13C.
Ces expériences permettent d’identifier un carbone d’un résidu i et le même type de carbone issu du résidu i-1 (en passant par le couplage scalaire NCO). On obtiendra les déplacements chimiques du triplet (Ni, HiN, Ci, Ci-1). Les carbones peuvent être tour à tour les C, les CO et les Cβ.et les expériences correspondantes sont appelées HNCA et HN(CO)CA, HN(CA)CO et HNCO, HN(CA)CB et HN(COCA)CB. La notation entre parenthèses signifie que le transfert d’aimantation se fait via ces atomes mais qu’ils ne sont pas édités.

Une variante séquentielle est appliquée pour l’identification des fréquences en Cβ dans les protéines doublement marquées. Contrairement aux échantillons deutérés, qui exploitent l’augmentation du temps de relaxation des spins des carbones liés à des deutérons en utilisant des expériences du type-HNC (HN(CA)CB et HN(COCA)CB) qui partent du proton amide, on préférera utiliser les expériences CB(CA)NH et CB(CACO)NH, qui sont alors plus sensibles, sur un échantillons doublement marqué mais protoné (Figure 9) . L’ensemble des informations redondantes, permet de connecter des résidus successifs dans la séquence et donc de retracer la connexion de toute la chaîne peptidique.



Les atomes en rouges sont ceux dont le déplacement chimique est observé et mesuré.

Les atomes en verts sont impliqués dans le tranfert d’aimantation mais ne sont pas observés dan le spectre final.

Les flèches bleues indiquent la direction du transfert d’aimantation.




Figure 9 : Exemples d’expériences triple résonance pour l’attribution de la chaîne principale d’une protéine marquée 15N et 13C.
Enfin un quatrième couple d’expériences, HN(COCA)H et HN(CA)H permet toujours sur le même principe, d’attribuer les H d’une protéine non deutérée.

Notons une différence pour les deux catégories d’expériences complémentaires : les expériences faisant intervenir le couplage scalaire NCO ne présente qu’un seul pic de corrélation par résidu alors que dans les expériences faisant intervenir le couplage NCA, peuvent se trouver deux pics par résidus, chacun provenant d’une corrélation avec le carbone i et i+1, en raison des valeurs de constantes de couplages 1JN-C (-11 Hz) et 2JN-C (7 Hz) proches. La différence d’intensité des deux pics, due au fait que 1JN-C > 2JN-C, peut permettre de distinguer dans une même expérience le déplacement chimique provenant du Ci de celui provenant du Ci-1 mais il est préférable de vérifier une telle attribution à l’aide de l’expérience complémentaire (qui sera dans ce cas l’expérience HN(CO)CA).

Dans le cas de très grosses protéines, l’identification d’un quatrième noyau peut s’avérer nécessaire. Des expériences en 4 dimensions (HNCACO et HNCOCA [xciii]) viennent encore améliorer la résolution des spectres. Enfin, il existe des expériences, dites à dimentionalité réduite qui présentent l’avantage de détecter 3 (ou 4) types de noyaux dans une seule expérience à 2 (ou 3) dimensions [xciv, xcv, xcvi].

L’attribution de la chaîne principale s’effectue en exploitant l’information séquentielle contenue dans les triplets de fréquences combinée aux valeurs particulières des déplacements chimiques de certains résidus (Figure 10).

Cette étape d’attribution de la chaîne principale peut être assistée par des programmes d’attribution automatique tels que Autoassign [xcvii] ou Alps [xcviii] ou encore smartnotebook associé au logiciel Nmrview [xcix].



Figure 10 : Déplacements chimiques des 13C des chaînes latérales [c]
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