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III.4.2-Le transfert de centre

Que cherche t-on à connaître?

- le type de centre transféré

- la spécificité du transfert

- le mécanisme moléculaire

Des études menées au laboratoire, et effectuées avec la protéine holo-SufA et la biotine synthase (BioB) comme protéine acceptrice, ont permis de montrer que la réaction passe par la formation rapide d'un complexe entre les deux protéines. Aucun complexe ne se forme si la protéine cible contient déjà un centre [Fe-S], ou si l'apoSufA est incubée avec l'apoBioB, ou l'holoSufA avec l'holoBioB [Error: Reference source not found], suggèrant que le centre [Fe-S] contenu dans les protéines contrôle l'association. D'autre part, le centre [Fe-S] est protégé du solvant puisque la présence de chélateurs n'inhibe pas le processus de transfert [Error: Reference source not found]. Les derniers résultats du laboratoire montrent enfin que le transfert de centre est un processus rapide, prenant place en quelques minutes, et que l'étape lente est la dissociation du complexe (k = 0.03 min-1) aboutissant à la forme active libre de holoBioB.

Lorsque les mêmes expériences ont été effectuées avec un mutant de la protéine BioB, dans laquelle une des cystéines ligand du centre a été changée en alanine, il a été observé que:

- le complexe est toujours présent, montrant que les cystéines ne participent probablement pas à la stabilisation du complexe [Error: Reference source not found].


- il n'y a pas de transfert du centre [Fe-S], suggérant que ce processus est guidé par l'attaque directe des cystéinates de la protéine acceptrice (BioB) sur le centre [Fe-S] de SufA. La réaction de transfert pourrait donc être décrite comme une attaque nucléophile au cours de laquelle les cystéines de la protéine SufA sont libérées et remplacées par celles de la protéine BioB (Figure 12).

Figure 12 : Processus de transfert de l'holo SufA à l'apo BioB

(Fontecave M, Ollagnier de Choudens S, Py B,Barras F (2005) J Biol Inorg Chem:1-9)
Chapitre II


Etude par RMN d’une protéine de grande taille

Si la détermination de la structure de la protéine SufA représente un enjeu important dans le cadre de nos recherches, notons qu’elle s’inscrit dans un processus plus général amorcé depuis quelques années dont l’objectif est la détermination des structures tridimensionnelles de l’ensemble des protéines identifiées. Ces entités, constituant entre 20 et 30 % de la masse cellulaire, possèdent des fonctions très diverses et essentielles à la vie de la cellule, et l’éthymologie de leur nom résume, à elle seule, leur importance. Après le décryptage complet du génome humain [lxvi], qui permet d’identifier un nombre considérable de protéines par leur séquence d’acides aminés, les biologistes cherchent maintenant à déterminer leur structure tridimensionnelle et leur dynamique, espérant ainsi aider à la compréhension de la fonction de chacune d’entre elles. La vision directe de tels objets biologiques n’est malheureusement pas possible en raison de leur petite taille de quelques centaines d’Angströms (Å), alors que les microscopes optiques ne permettent d’observer que jusqu’à 400 nanomètres (nm). Les chercheurs ont développé trois techniques qui permettent d’atteindre des échelles de taille aussi petites. La première, la microscopie électronique, est idéale pour étudier des virus ou des complexes biomoléculaires puisqu’elle permet d’atteindre des résolutions d’environ 10 Å. Toutefois, la caractérisation des protéines requiert une résolution de l’ordre de l’Angström qui ne peut être atteinte que par les deux techniques que sont la radiocrisatllographie des rayons X et la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN).

La plus ancienne, la radiocristallographie nécessite l’obtention d’un monocristal de protéine, sur lequel sont diffractés les rayons X. La déviation du faisceau informe sur la structure de la protéine. La RMN, qui n’a émergé qu’au cours des vingt dernières années, exploite les propriétés magnétiques des noyaux (spin) de certains atomes des molécules étudiées. Même si la radiocristallographie a permis la résolution de nombreuses structures, l’utilisation de la RMN peut se justifier sur trois plans : d’abord toutes les protéines ne cristallisent pas correctement et facilement ; ensuite, l’état cristallin peut induire des modifications structurales de la protéine alors que la RMN permet l’étude de protéines en solution ; enfin la RMN permet d’accéder aux fluctuations structurales dans le temps par rapport à une conformation moyenne, donc à la dynamique de la protéine.

En plaçant la protéine dans un champ magnétique intense, il se produit une levée de la dégénérescence ou séparation des niveaux énergétiques des différents états de spin du noyau considéré. Cette séparation est propre à chaque noyau, car elle dépend de l’environnement chimique, et est proportionnelle au champ magnétique (Figure1). La connaissance de cette séparation, permise par l’absorption puis l’émission de rayonnements électromagnétiques, rend donc possible l’identification de chaque noyau observable (étape d’attribution). On peut ensuite corréler des paires de noyaux entre eux pour obtenir des informations structurales mais aussi dynamiques. Cette technique est aussi très adaptée à d’autres applications telles que des études d’interactions intermoléculaires ou de repliements protéiques [lxvii, lxviii]. Toutefois, la RMN est confrontée à ses propres contraintes, car la protéine étudiée doit être soluble et non agrégée à des concentrations de l’ordre du millimolaire mais, surtout, la masse de la protéine étudiée est une limitation majeure. Bien que des records de détermination de structures aient été enregistrés sur des monomères de 30 KDa [lxix,lxx] et un homodimère de 47 KDa [lxxi], la taille limite actuelle pour une étude de routine se situe aux alentours de 20 KDa. Au-delà, nous verrons que des phénomènes physiques viennent dégrader le signal RMN au point de ne plus pouvoir l’exploiter. Toutefois, cette limite est sans cesse repoussée grâce à diverses avancées techniques que nous décrirons.




Figure 1: Principe de la séparation des niveaux d'énergie en RMN

Lorsqu’on place l’échantillon RMN dans le champ magnétique B0, on observe une levée de dégénérescence des états de spins. L’écart en énergie est proportionnel à B0. La différence de populations (qui obéissent à la loi de Boltzmann) entre les niveaux d’énergies permet le phénomène RMN.

I-ÉTUDE PAR RMN D’UNE PROTÉINE DE MASSE MOLÉCULAIRE ÉLEVÉE

I.1-Limites imposées par la méthode de la RMN
I.1.1-Limites liées aux propriétés de l’échantillon biologique
La sensibilité des expériences RMN croît principalement avec l’intensité du champ magnétique (en B03/2) et la quantité de spin identique (donc de molécules) présents dans l’échantillon en solution. Les volumes de détection restant quasiment inchangés quelque soit la sonde utilisée, pour un champ magnétique donné, le principal moyen d’accroître la sensibilité des expériences est donc d’augmenter la concentration de la protéine étudiée. Quelques dizaines de milligrammes de protéines (avec une pureté supérieure à 95%) suffisent à la préparation d’un échantillon de 500 mL à une concentration de l’ordre de 1 à 2 mM. La pureté a un impact décisif sur la qualité des spectres, mais aussi sur la longévité de l’échantillon qui peut se trouver dégradé par des protéases présentes. En revanche, l’expérience RMN ne cause pas intrinsèquement de dommages à la protéine. Cette dernière doit être stable pendant plusieurs semaines à une température pouvant se situer entre 10 et 40 °C.

I.1.2-Limites liées à la taille de la protéine étudiée
C’est la principale limite de la RMN comparée à la radiocristallographie (qui rencontrent aussi les mêmes problèmes décrits ci-dessus). Deux difficultés majeures apparaissent avec l’accroissement de la taille de la protéine.

D’une part, alors que la gamme de déplacements chimiques des différents atomes détectables reste inchangée (12 ppm pour le proton, 30 ppm pour l’azote et le carbone α), on observe des superpositions accidentelles des nombreux signaux ou pics RMN (Figure 2) qui peuvent être à l’origine de nombreuses ambiguïtés dans l’attribution des systèmes de spin.




Figure 2 : RMN en fonction de la taille des protéines
D’autre part, la largeur à mi-hauteur des raies de résonances (des fonctions lorentziennes) est proportionnelle à la vitesse de relaxation transversale R2 :
S() = [1/R2] / [1+(1/R2)2(-0)2] (2.1)
où ω0 est la fréquence de Larmor. Or R2 est proportionnel à τc le temps caractéristique de réorientation globale de la protéine, lui même dépendant de la taille de la molécule. Dans l’approximation d’une molécule sphérique de rayon r, τc a pour expression :
c = 4πr3 / 3kBT (2.2)
où η est la viscosité du milieu, T la température et kB la constante de Boltzman (1.3806.10-23 J/K). Ainsi la largeur des signaux RMN augmente avec la taille de la protéine et donc que plus la taille de la protéine étudiée est grande, plus la sensibilité et la résolution des expériences RMN en sont affectées comme on peut le voir sur la figure 2.

I.2-Les principales avancées visant à repousser les limites de la RMN
I.2.1-Les spectromètres
La puissance des aimants, d’abord résistifs puis supraconducteurs, n’a cessé d’augmenter. En 40 ans, elle a été multipliée par 10, passant de 2.1 Tesla en 1962 (correspondant à une fréquence de résonance du 1H à 90 MHz) à 21 Tesla en 2002 (fréquence.1H  900 MHz). Cette évolution représente un progrès considérable puisque la résolution des spectres RMN augmente linéairement avec B0 et la sensibilité augmente en B03/2 [lxxii]. Ainsi un spectre RMN issu d’un spectromètre 800 MHz est 2 fois mieux résolu et 6.4 fois plus sensible que celui issu d’un spectromètre 400 MHz. Ces améliorations entraînent une diminution sensible des recouvrements spectraux accidentels et une augmentation de l’intensité des raies de résonances. L’interprétation des données s’en voit simplifiée et les limites liées à la concentration de l’échantillon et à la taille de la molécule en sont repoussées. Parallèlement, la stabilité et l’homogénéité spatiale des bobines, deux paramètres importants pour la qualité des mesures, se sont améliorées.

I.2.2-Les cryosondes
Une avancée technologique importante pour tenter d’abaisser la concentration minimale d’étude d’un échantillon est le développement des cryosondes. Celles-ci sont plongées dans un bain d’hélium, ce qui permet de minimiser le bruit thermique et d’augmenter ainsi la sensibilité des expériences d’un facteur 2 ou 3. Notons toutefois que cette amélioration de la sensibilité peut être perturbée par la présence de sel à forte concentration dans l’échantillon. En effet des courants électriques induits, aux niveaux de ces petites molécules ioniques, perturbent la sensibilité de la cryosonde et par conséquent amoindrissent le gain que cette technologie apporte.

I.2.3-Le marquage isotopique des échantillons pour une RMN multidimensionnelle
La RMN des biomolécules est basée sur l’étude des interactions entre isotopes stables de spin nucléaires ½ .Parmi les atomes constituants les protéines, c'est-à-dire l’hydrogène, le carbone, l’azote, l’oxygène et le soufre, seul l’atome d’hydrogène possède une espèce majoritaire de spin 1/2. L’azote et le carbone possèdent chacun un isotope de spin 1/2 (15N et 13C) mais dont la très faible abondance naturelle (respectivement 0.4% et 1.1%) ne permet pas d’atteindre une sensibilité suffisante pour les études structurales. Ceci explique en partie pourquoi la RMN des biomolécules a d’abord été une spectroscopie homonucléaire (1D) du proton et ce jusqu’au début des années 1970. Toutefois, ces études ne pouvaient s’appliquer que sur de petits peptides pour les raisons que nous venons de décrire précédemment.

L’avènement de la RMN pulsée et l’apparition d’expériences RMN à deux dimensions (2D) au cours des années 1970, permettra de résoudre la première structure tridimensionnelle d’une protéine en 1985 [lxxiii]. Avec le développement de la spectroscopie multidimensionnelle (2D, 3D) hétéronucléaire (corrélation entre spins d’espèces atomiques différentes) vers la fin des années 1980, l’étape d’attribution des raies de résonances est plus aisée et la RMN, comme technique de détermination de structure 3D, devient accessible à des protéines de plus de 20 kDa. Les techniques de marquage isotopique deviennent par conséquent un outil essentiel pour l’étude en solution des biomolécules de cette taille.

Il existe deux types de marquage isotopique : le marquage uniforme et le marquage spécifique. Si l’étude structurale d’une protéine peut entièrement être réalisée à l’aide d’échantillon uniformément marqué, l’utilisation d’échantillons marqués spécifiquement peut compléter et même faciliter l’étude. En effet, comme seuls les résidus marqués sont détectables (un filtre hétéronucléaire est alors appliqué pour masquer les signaux des 1H non couplés), les spectres RMN de ce type d’échantillons se trouve être nettement simplifiés. Les principaux inconvénients du marquage spécifique sont un coût élevé et la necessité de produire plusieurs échantillons.

Un autre type de marquage a fait son apparition récemment. Il s’agit du marquage par intéine, c'est à dire un enrichissement isotopique sélectif d’une portion de protéine (de préférence définissant un module) [lxxiv]. Cette approche conduit à une simplification considérable des spectres RMN pour des protéines modulaires de grande taille par la réduction du nombre de résonances observables, tout en conservant la structure de la protéine intacte. Bien qu’encore peu pratiquée en raison de l’expertise qu’elle requiert, cette technique pourrait faire reculer la taille limite actuelle des protéines étudiables par RMN. Elle doit toutefois être associée à d’autres techniques pour remédier, comme nous le verrons, au problème de relaxation.

I.2.4-La deutération
La deutération, qui consiste à remplacer tous ou une partie des protons (1H) présents dans une protéine par des deutérons (2H ou D), est aussi un marquage isotopique pratiqué pour l’étude des protéines en solution, bien qu’elle n’apporte pas de noyau supplémentaire à détecter (spin de 2H égal à 1).

La deutération aléatoire (uniforme) permet d’augmenter le rapport signal sur bruit des spectres hétéronucléaires multidimensionnels. Deux phénomènes sont à l’origine de cette amélioration : d’une part, la diminution de la vitesse de relaxation des spins 13C et 15N et, d’autre part, la suppression de la diffusion de spin.

En effet, la substitution d’un 1H par un D entraîne une diminution significative de l’interaction dipolaire entre cet isotope et un spin 13C (ou 15N) directement lié, en raison de la différence entre les valeurs de rapports gyromagnétiques des deux isotopes ( H 6.5 D). La vitesse de relaxation transversale, dont la principale source dans les expériences hétéronucléaires est l’interaction dipolaire, s’en trouve fortement diminuée [lxxv],. La contribution des protons à l’augmentation de la largeur des raies de résonances est donc amoindrie.

La figure 3 représente le temps de relaxation transversale (spin-spin) des noyaux de la chaîne principale en fonction du c de la molécule, suivant que la protéine soit perdeutérée (c'est à dire que tous ses protons non échangeables ont été substitués par des deutérons) ou pas. On constate que l’amélioration est conséquente pour le C (T2 divisé par un facteur 9) et le HN (T2 divisé par un facteur 2). En revanche, aucun changement notable n’est observé pour le CO et le N puisqu’ils ne sont pas liés covalemment à des deutérons [lxxvi].


Figure 3 : T2 de différents noyaux calculés en fonction du τc de la molécule et de la deutération [76]
De plus, la deutération entraîne une diminution de la densité spatiale des spins 1H, donc une réduction de la fuite de la magnétisation à travers de multiples chemins de relaxation homonucléaire 1H-1H (Figure 4). Cet effet, appelé diffusion de spin, contribue à la relaxation longitudinale et augmente avec la masse de la protéine étudiée. Ainsi, en diminuant la diffusion de spin, on favorise la sélectivité de l’information dans le cadre des expériences hétéronucléaires (puisque l’on a des T2 plus long), améliorant ainsi la qualité des spectres.




Figure 4 : Deuxième phénomène lié à la deutération :

  1. Effet de la diffusion de spin dans les protéines non deutérées.

  2. Suppression de l’effet dans le cas de protéines deutérées.

Un taux de deutération compris entre 50 et 75 % suffit à compenser la diminution de la sensiblité, due à la perte du nombre de protons, par la diminution de la largeur des raies de résonances [lxxvii], même si les effets sont maximums sur un échantillon perdeutéré. Notons que l’augmentation du rapport signal sur bruit des spectres RMN apportée par la deutération joue un rôle important dans la détermination de structure de grosse protéines par RMN [lxxviii].

Toutefois, les avantages remarquables qu’apporte la deutération ne sont pas sans contrepartie. Suite à la deutération, de la protéine d’intérêt, obtenue par surexpression dans un milieu complètement deutéré où la seule source d’hydrogène est l’eau lourde et le glucose. Il sera donc nécessaire d’effectuer l’échange des 2HN par des 1HN, indispensable à l’enregistrement des expériences RMN. Mais cet échange peut être plus ou moins long, particulièrement dans les régions de structures secondaires moins accessibles au solvant. D’autre part, le nombre de contraintes de distance, qu’il convient de mesurer pour le calcul de structure est fortement réduit par rapport à une protéine protonée. Il est d’ailleurs suggéré que pour des protéines de taille modérée, un taux de deutération de 50 % optimise la sensibilité des expériences pour l’attribution des chaînes latérales et représente un bon compromis avec l’enregistrement des spectres nOe [lxxix]. Dans le cas de protéines de taille plus importante (plus de 25 kDa), des taux élevés de deutération sont alors nécessaire à l’enregistrement des spectres bien résolus mais la collecte des nOe nécessaire à la détermination de la structure tridimensionnelle haute résolution devient difficile. Il s’agit donc de trouver un bon compromis de manière à pouvoir effectuer l’attribution de l’ensemble de la protéine et la collecte de contraintes nOe, ce qui peut se traduire par une période d’essais consommatrice en échantillons et temp. De nouvelles méthodes se développent actuellement tel que le marquage spécifique qui peut permettre d’obtenir un échantillon entièrement deutéré sauf au niveau des méthyles des valines, leucines et isoleucines [lxxx]. Ces résidus étant très souvent impliqués dans le cœur hydrophobe des protéines, la mesure de contraintes nOe sur l’extrémité de leur chaîne latérale peut apporter des informations structurales très précieuses [lxxxi].
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