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III.2-Le système SUF

Le système Suf d'E. coli est particulièrement étudié au laboratoire; il est composé de six protéines organisées en deux complexes SufSE (hétérodimère SufS+SufE) et SufBCD (hétéro trimère SufB+SufC+SufD), auxquels s'ajoute la protéine SufA. Il s'avère être le système est le plus simple parmi les opérons impliqués dans la biosynthèse des centres [Fe-S]. En effet chez les eucaryotes, on distingue au moins une vingtaine de protéines ISC impliquées dans ce processus.

III.2.1-Analyse physiologique

L'importance du système SUF dans la biosynthèse des centres [Fe-S] est venu des observations suivantes :

1) La mutation de sufD et sufS d'E. coli induit une instabilité du centre [2Fe-2S] de la réductase du fer ferrique (FhuF) d'E. coli [xxxiv].

2) Chez E. coli lorsque l'opéron entier isc est délété, 2 à 10% des activités des protéines [Fe-S] sont conservées. La surexpression de l'opéron suf restaure complètement l'activité de ces mêmes protéines, alors que l'inactivation des deux opérons, isc et suf, est létale pour la cellule [xxxv].

3) La délétion de sufC chez E. chrysanthemi provoque une diminution de l'import de fer, ainsi que la diminution de l'activité d'enzymes à centres [Fe-S]. De plus on observe une plus grande sensibilité au stress oxydant [Error: Reference source not found].

L'importance du système SUF, dans les conditions de stress oxydant et de carence en fer, est venue des observations suivantes :

1) Le système SUF est régulé par le répresseur Fur, senseur de l'état de fer chez E. coli et E. chrysanthemi [xxxvi].

2) Il est aussi régulé par le régulon OxyR, senseur du peroxyde d'hydrogène chez E. coli [xxxvii].

3) L'expression des gènes suf est induite par l'addition de peroxyde d'hydrogène ou des générateurs de superoxyde ainsi que par la carence en fer [Error: Reference source not found,xxxviii].

III.3-Les protéines Suf

Il a été montré de manière non ambiguë que cinq des six protéines sont organisées en deux complexes distincts, nommés SufSE et SufBCD, tous deux localisés dans le cytoplasme. La protéine SufA, quant à elle, ne forme aucun complexe avec les autres protéines de l'opéron aussi bien in vivo qu' in vitro [xxxix].

III.3.1-Le complexe SufSE

SufS est une protéine homodimèrique possédant un cofacteur : le pyridoxal phosphate (PLP). Elle se caractérise par une activité cystéine désulfurase [xl,xli] en catalysant la conversion de la L-cystéine en L-alanine. Le site actif contient une cystéine conservée (Cys 364 chez E. coli), essentielle à l'activité.

SufE est une protéine homodimèrique, qui forme un complexe 1:1 avec SufS. Elle ne possède pas d'activité cystéine désulfurase en soi. Associée à SufS, elle permet une stimulation de l'activité cystéine désulfurase de cette dernière [Error: Reference source not found,xlii]. Des études de mutagenèse dirigée ont montré que la Cys 51 de SufE était essentielle à cette stimulation de l'activité [xliii,xliv]. La réaction procède, premièrement, par la formation d'un persulfure sur la Cys 364 de SufS, par attaque nucléophile de cette cystéine sur un adduit PLP-cystéine (Figure 7 étape 3). Il s’ensuit la formation d’alanine et de PLP libre après l’hydrolyse. Dans un deuxième temps, un des atomes de soufre du persulfure de SufS est transféré à la Cys 51 de SufE par une réaction de transpersulfuration (Figure 8). Ce transfert spécifique d'atome de soufre a été parfaitement démontré par des expériences de marquage isotopique (35S) et par spectrométrie de masse [Error: Reference source not found,Error: Reference source not found]. L'utilisation de SufE mutée au niveau de la Cys 51 a démontré que cette cystéine est l'unique site accepteur de soufre.




Attaque nucléophile

Cys364

SufS



NB : P sur le cycle du PLP représente le phosphate


Figure 7 : Mécanisme de l'activité cystéine désulfurase.



transpersulfuration


Figure 8 : Activité cystéine désulfurase et transpersulfuration.

(Fontecave M, Ollagnier de Choudens S, Py B,Barras F (2005) J Biol Inorg Chem:1-9)

Toutefois, le mécanisme moléculaire responsable de l'augmentation de l'activité cystéine désulfurase de SufS (associée avec SufE), n'est toujours pas connu à ce jour. La structure cristallographique de SufS d'E. coli, déterminée par Rayons X [xlv,xlvi], montre que la cystéine 364 est éloignée du site où se trouve l'adduit PLP-cystéine, rendant la formation du persulfure quasi impossible. Ceci explique pourquoi l'activité cystéine désulfurase de SufS est extrêmement faible comparée aux autres cystéines désulfurases [xlvii]. Ceci est cohérent avec de récentes études cinétiques montrant qu'en effet l'étape limitante de la réaction est l'attaque nucléophile de l'adduit PLP-cystéine par la cystéine 364 [xlviii]. D'autre part, la structure cristallographique de SufE montre que la Cys51 est peu accessible. Elle est localisée sur l'extrémité d'une boucle qui lie deux brins  anti-parallèles et se situe dans une cavité hydrophobe. Par conséquent il est difficile d'envisager une réaction de transpersulfuration entre SufS et SufE sans invoquer un changement conformationnel des deux protéines, permettant le rapprochement entre la cystéine 364 et l'adduit PLP-cystéine d'une part et une meilleure accessibilité de la Cys 51 d'autre part. Ceci rendrait possible la réaction de persulfuration qui se traduirait par une augmentation de l'activité cystéine désulfurase de SufS. L’obtention de la structure tri-dimensionnelle du complexe SufS-SufE, non disponible actuellement, permettrait probablement de fournir quelques éclairages sur cette question.

III.3.2-Le complexe SufBCD

Des expériences in vivo et in vitro ont montré que les trois protéines SufB, SufC et SufD d'E. coli et E. chrysanthemi forment un complexe stable : SufC présente une activité ATPase alors que les fonctions de SufB et SufD ne sont pas connues. Le complexe SufBCD augmente l'activité cystéine désulfurase du complexe SufSE [Error: Reference source not found], mais curieusement cette stimulation n'est pas ATP-dépendante. Des études récentes réalisées au laboratoire montrent que le complexe, et notamment SufBC, interagit avec SufE et, chose intéressante, un transfert de soufre de la protéine SufE à la protéine SufB a été démontré, avec formation de persulfures au niveau de résidus cystéines. En présence de fer et d'électrons, la forme soufrée de la protéine SufB est capable de former en son sein un centre [Fe-S], de type [4Fe-4S], réductible et stable, dont il reste à déterminer le rôle au sein du processus de biosynthèse des centres [Fe-S].

III.3.3-La protéine SufA

SufA est une protéine cytoplasmique homodimérique, homologue à la protéine IscA, présent dans l'opéron isc (Figure 9). De nombreuses études ont été réalisées ces dernières années sur ces deux protéines [xlix,l]. Les propriétés de SufA sont les suivantes : (i) SufA est obtenue principalement sous la forme apo après purification aérobie ou anaérobie [li] ; (ii) SufA est capable de chélater un centre [Fe-S] après traitement de l'apoprotéine avec du fer (Fe2+) et du soufre (S2-) en condition d'anaérobiose [Error: Reference source not found] ; (iii) Ces centres [Fe-S] sont instables et peuvent être transférés efficacement à une apoprotéine cible pour former des centres [2Fe-2S] ou [4Fe-4S] [Error: Reference source not found,lii] ; (iv) Le centre est très probablement chélaté par les trois cystéines conservées (C50XnC114GC116 pour E. coli) dont l’espacement est caractéristique des protéines de type A. Ceci a permis de définir SufA comme une protéine d'échaffaudage ("scaffold") au sein de laquelle, le fer et le soufre sont préassemblés en centre [Fe-S] qui est ensuite transféré à différentes apoprotéines cibles.




Figure 9 : Alignement de séquences de protéines homologues de type A

En général, après reconstitution, un monomère de SufA ne peut pas lier plus de deux atomes de fer et deux atomes de soufre. Cependant l'analyse de ces préparations par spectrométrie Mössbauer a montré que deux formes de centres, [2Fe-2S] et [4Fe-4S], existaient dans ces conditions [Error: Reference source not found]. SufA contiendrait un mélange de polypeptides chélatant un centre [2Fe-2S] par monomère et des polypeptides chélatant un centre [4Fe-4S]. Ce dernier pourrait se situer entre deux sous-unités ou être présent dans une seule unité, la deuxième étant dépourvue de centre. La présence de ces différents centres dans SufA peut s'expliquer de la façon suivante:

- SufA contient un centre [2Fe-2S] à partir duquel un centre [4Fe-4S] peut se former artificiellement à cause de l'excès de fer et de soufre présents dans le milieu réactionnel.

- SufA contient un centre [4Fe-4S] pouvant se décomposer en un centre [2Fe-2S].

- SufA est capable d'assembler les deux types de centres.

Aujourd'hui les questions essentielles qui se posent sont :

- quels types de centres sont réellement formés au sein de SufA? Déterminer la nature du centre [Fe-S] est un véritable casse tête. En effet, une hétérogénéité similaire de centres a été rapportée dans le cas des protéines IscA d'A. vinelandi et d'E. coli [Error: Reference source not found,liii] alors que, seuls des centres [2Fe-2S] ont été détectés dans IscA de S. pombe et de Synechocystis [Error: Reference source not found,liv]. De plus, dans ce dernier cas les avis divergent quant à la quantité de fer par chaîne polypeptidique : soit un fer / soit deux fer par chaîne polypeptidique.

- quels sont les ligands des centres [Fe-S]? Les protéines d'échaffaudage possèdent trois résidus cystéines conservés, proposés comme étant les ligands des centres [Fe-S] [Error: Reference source not found, Error: Reference source not found, Error: Reference source not found, lv, lvi, lvii], même si leur rôle exact n’a pas été démontré. En effet, des expériences menées in vivo sur Isa1p de la levure S. pombe ont montré que ces trois cystéines étaient essentielles à la fonction de la protéine [Error: Reference source not found,Error: Reference source not found]. Par contre, les mutants CysAla de Isa1p sont tout aussi capables que la forme sauvage in vitro d'incorporer des centres [2Fe-2S] avec une efficacité de transfert identique [lviii]. Enfin, des expériences effectuées in vitro sur IscA de Synechocystis ont montré que seules les deux cystéines de la partie C-terminale étaient essentielles à la formation et au transfert du centre [2Fe-2S] [Error: Reference source not found,Error: Reference source not found]. On voit bien toute la complexité du problème. Une solution serait d'analyser la protéine directement dans la cellule par spectroscopie Mössbauer, en suivant la stratégie développée pour caractériser les centres [Fe-S] de la biotine synthase ou la protéine FNR in vivo [lix,lx]. On pourrait envisager de purifier SufA en anaérobiose mais l’instabilité du centre [Fe-S] rend l’expérience délicate.

L'obtention d'une structure tridimensionnelle de la forme holo (protéine possédant son centre métallique) de SufA serait extrêmement précieuse, pour l'identification des ligands du centre [Fe-S].

Un des objectifs de cette thèse est donc de déterminer la structure par RMN de la protéine SufA : la forme apo dans un premier temps, la protéine holoSufA dans un deuxième temps. Nous espérons ainsi pouvoir observer des modifications structurales au niveau des résidus cystéines et par conséquent déterminer les ligands du centre [Fe-S].

Il est toutefois important de mentionner ici que très récemment l'hypothèse qu'IscA et SufA sont des protéines d'échaffaudage a été remise en cause par des expériences biochimiques démontrant une forte affinité d'IscA d'E. coli pour le fer (Kd = 10-17 M) suggérant un rôle de chaperone à fer plutôt que de centre [Fe-S] [lxi,lxii]. SufA et aussi IscA de A. Vinelandii ont d'autre part été rapportées n'avoir aucune affinité pour le fer [Error: Reference source not found,Error: Reference source not found]. Ces résultats sont en contradiction avec ceux obtenus sur SufA et IscA d'E. coli. La pertinence physiologique de telles formes IscA-Fe ou SufA-Fe nécessite donc d'être considérée prudemment, à la vue de la récente structure de la protéine holo IscA, mais néanmoins ne doit pas être complètement écartée [lxiii].

III.4-Mécanisme d’assemblage des centres [Fe-S] et transfert

Peu de choses sont connues au niveau moléculaire en ce qui concerne des deux réactions dépendant de SufA à savoir l'assemblage du centre au sein de sa chaîne polypeptidique et le transfert du centre à des protéines cibles.

III.4.1-L'assemblage de centre

Le fait que le donneur de fer physiologique ne soit pas connu, rend cette étape difficile à étudier. Toutes les études in vitro utilisent un sel ferreux comme source de fer, et ainsi les conditions de réactions ne reproduisent pas exactement la situation in vivo. Par ailleurs, il est hautement probable que le donneur de soufre soit un persulfure localisé au niveau d'une cystéine réactive du système cystéine désulfurase. Dans le cas du système SUF, nous faisons l'hypothèse que cette cystéine est la cystéine 51 de SufE.

L'idée est de comprendre comment et dans quel ordre s'effectue l'insertion du fer et soufre au sein du site actif de SufA, défini comme comprenant les trois cystéines conservées (cys 50, cys 114, cys 116). Dans l'hypothèse de la formation d'un centre [2Fe-2S] à l'interface de deux sous-unités on peut proposer deux mécanismes [lxiv]:

1) "Fe premier, S second" (Figure 10). Dans un premier temps, deux atomes de Fe2+sont chélatés par les ligands cystéines conservés. Dans un deuxième temps, le soufre est incorporé via le système SufS. Cette étape implique une réduction à 2 électrons, du soufre (S0) en sulfure (S2-), fournis par les ions ferreux. La formation terminale du centre [Fe-S] requiert deux électrons supplémentaires qui pourraient provenir soit d'une source exogène soit d'un groupe actif dithiol.




Figure 10 : Mécanisme dit "Fe premier, S second"

(Fontecave M, Ollagnier de Choudens S, Py B,Barras F (2005) J Biol Inorg Chem:1-9)

2) "S premier, Fe second" (Figure 11). Dans un premier temps, il y a réaction de transpersulfuration durant laquelle les cystéines nucléophiles de SufA acquièrent des atomes de soufre de SufE par l'attaque de ses persulfures, générant ainsi des persulfure sur SufA. Dans un deuxième temps, les ions ferreux sont incorporés. La formation du centre [2Fe-2S] à l'interface se produit après une réduction à deux électrons de chacun des deux atomes de soufre (S0), deux électrons fournis par les deux fer ferreux et deux par un dithiol rédox par exemple.




Figure 11 : Mécanisme dit "S premier, Fe second"

(Fontecave M, Ollagnier de Choudens S, Py B,Barras F (2005) J Biol Inorg Chem:1-9)

Des expériences biochimiques et spectroscopiques in vitro effectuées dans notre laboratoire (thèse Sendra Maïté, manuscrit soumis) ont montré que SufA accepte du soufre de SufE au niveau des trois cystéines conservées. Cette forme (SufA-SSH) en présence de fer et d’électrons est capable de former un centre [Fe-S].

Par ailleurs d’autres expériences biochimiques et spectroscopiques in vitro ont également montré que SufA est capable de lier le fer ferreux (1.6 fer par protéine) au niveau d’un site ne contenant pas les cystéines conservées. Même si ce fer est faiblement lié à la protéine (puisqu’un traitement à l'EDTA conduit à une protéine quasiment dépourvue de fer) on est capable, à partir de cette forme (SufA-Fe) en présence d’ions sulfures et d'électrons, de reconstituer un centre [Fe-S] au sein de SufA. Il semblerait donc que l'on soit en présence de deux sites sur la protéine ; un site où sont fixées les atomes de soufre au niveau des cystéines conservées et un site, non déterminé, où se fixerait le fer. Tous les résultats obtenus ne permettent pas de savoir qui, du soufre ou du fer, est inséré le premier.

Cette problématique de l'ordre d'insertion des atomes de fer et soufre dans les protéines d’échaffaudage a déjà été abordé avec la protéine IscU, mais il n'y a pas consensus sur le sujet [Error: Reference source not found, lxv]. Alors que certains proposent que IscU fixe d'abord le fer (avec une affinité égale à 68µM), d'autres proposent plutôt que le soufre vienne en premier [Error: Reference source not found]. Néanmoins, il n'a pas été possible de compléter l'assemblage du centre dans IscU par incubation de cette forme sulfurée avec du fer [Error: Reference source not found].
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