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I.1.3-Les centres [4Fe-4S]

Ces centres adoptent une géométrie de cube déformé où chacun des quatre atomes de fer est coordiné à trois atomes de soufre inorganique et un groupement thiolate d'une cystéine ligand (Figure 3). Il existe en fait une déformation du cube résultant de la tétravalence des atomes de fer qui occupent les sommets de l'édifice alternativement avec les atomes de soufres inorganiques.

Contrairement aux autres types de ferrédoxines, les centres [4Fe-4S] ne sont pas liés à une séquence consensus type. Au contraire, une étude bio-informatique [xiii] récente a montré qu'il existait, jusqu'à présent, une quarantaine de séquences différentes impliquées dans la chélation de ces centres.

Cette structure existe sous trois états d'oxydation différents, constituant ainsi deux couples rédox : les couples [4Fe-4S]+2/+1 et [4Fe-4S]+3/+2.. Les protéines contenant ce dernier couple sont appelées HiPIPs (High Potential Iron Protein) en raison de la valeur élevée de leur potentiel d'oxydoréduction. Il convient de noter que la plupart des protéines [4Fe-4S] sont isolées dans l'état [4Fe-4S]2+, de spin total S=0, et par conséquent non détectable en RPE. On peut toutefois accéder à un centre réduit [4Fe-4S]+1 pouvant se décomposer en deux paires d'atomes de fer: une paire ferreuse (Fe2+,Fe2+) et une paire dite de valence mixte (Fe2.5+,Fe2.5+). Cette réduction conduit à un signal RPE situé à une valeur du tenseur gmoyen inférieur à 2 correspond à états de spin = 1/2. Les protéines HiPIPs, quant à elles, sont facilement repérables, puisqu'elles se manifestent dans l'état oxydé [4Fe-4S]+3 par un signal RPE dont la valeur du tenseur gmoyen est supérieur à 2 caractéristique d'un état de spin S=1/2.




Figure 3 : Représentation schématique d'un centre [4Fe-4S]

[4Fe-4S] +3

[4Fe-4S] +2

[4Fe-4S] +1

Fe 2+ , 3Fe 3+

S=1/2; g > 2

2Fe 2+ , 2Fe 3+

S=0

3Fe 2+ , Fe 3+

S=1/2, g < 2

Potentiel redox(a)

(+3/+2) = +50 à +400 mV

Potentiel redox(a)

(+2/+1) = -100 à -700 mV

(a) Potentiels rédox donnés par rapport à l'ENH, à pH 7 à 25°C.

I.1.4-Les centres [3Fe-4S]

Les ferrédoxines à centre [3Fe-4S], présentes dans le monde bactérien, possèdent un centre pseudo-cubique qui n'est pas relié à la protéine par des résidus organisés selon une séquence consensus et répertoriée. Les motif d'acides aminés correspondent à ceux des centres [4Fe-4S], dont ils sont issus, modifiés soit par des insertions, soit par des délétions ou des substitutions de résidus.

Un centre [3Fe-4S] contient trois ions Fe3+ ou deux Fe3+ et un Fe2+. A l'état oxydé, les trois atomes de fer sont couplés antiferromagnétiquement via les atomes de soufre inorganiques ce qui aboutit à un spin total S=1/2 ; la protéine est donc paramagnétique et le centre présente un signal RPE centré à g=2. Après réduction à un électron, le centre [3Fe-4S] est constitué d'un ion Fe 3+ et d'une paire d'atome de fer à valence mixte Fe2.5+ [xiv]. Ainsi le centre de spin total S=2 est dans un état paramagnétique uniquement détectable en mode parallèle en RPE.

Les centres [3Fe-4S] dérivent le plus souvent de la dégradation oxydative d'un centre [4Fe-4S] conduisant à l'inactivation de la protéine. Néanmoins, la présence de centre [3Fe-4S] dans certaines métalloenzymes actives a permis de montrer qu'ils pouvaient être des composants fonctionnels des protéines, dans les conditions physiologiques. Il faut aussi retenir la possibilité d'interconversion entre les formes [3Fe-4S] et [4Fe-4S], mécanisme proposé comme moyen de contrôle de certains métabolismes dans les réactions catalysées par certains centres [4Fe-4S], comme dans le cas de la Fumarate Nitrate Réductase (FNR) [xv,xvi].

I.1.5-Les centres complexes

De nombreuses équipes cherchent à comprendre et à déterminer le fonctionnement des centres [Fe-S] issus de complexes enzymatiques atypiques qu'on ne fera que citer dans ce paragraphe. Ces centres métalliques qui présentent des caractéristiques communes ont intéressé nombres de chercheurs pour les raisons suivantes :

- Tout d'abord d'un point de vue fondamental, car ils sont impliqués dans des réactions rédox exceptionnelles d'activation de substrats très stables (H2, N2, CO2, SO32-).

- Ils sont directement impliqués dans l'activité enzymatique.

- Ils contiennent un nombre d'atomes de fer et de soufre supérieur à 4, et une spectroscopie RPE complexe. Ce type de centre, dont quelques exemples sont présentés sur la figure 4, est bien illustré dans des revues [Error: Reference source not found,Error: Reference source not found,xvii].



Figure 4 : A centre de la protéine Sulfite réductase.

B centre de la protéine Carbone monoxyde déshydrogènase.

C et D sont les centres de la protéine Fer-Molybdène de la nitrogénase d'Azotobacter vinelandii.

(Beinert H, Holm RH, Munck E (1997) Science 277:653-659)

II-FONCTIONS DES PROTÉINES [Fe-S]

L'abondance des protéines fer-soufre dans un organisme donné est sujet à caution. En effet, une étude minutieuse de la littérature scientifique montre que 110 protéines [Fe-S] d' Escherichia coli ont été isolées jusqu'à présent. Toutefois, il a été montré qu'à ces 110 protéines, on pouvait ajouter 100 protéines potentielles [Error: Reference source not found]. Les protéines [Fe-S] représentent environ 5% de l'ensemble des protéines d' Escherichia coli. La potentialité d'un nombre important de nouveaux centres [Fe-S] à découvrir laisse entrevoir probablement de nouvelles fonctions biologiques et chimiques à ajouter à la liste sans cesse croissante du rôle des centres [Fe-S].

Si la première fonction biologique associée à des centres [Fe-S] fut celle de transférer des électrons, il n'en est plus de même aujourd'hui avec l'apparition de nouveaux types de centres [Fe-S]. En effet, à côté des centres "classiques" [2Fe-2S], [3Fe-4S], [4Fe-4S], il existe un certain nombre de centres exotiques (brièvement décrits ci-dessus). A cela s'ajoute une variété de ligands protéiques tels que des résidus histidine, arginine, aspartate, glutamate ou sérine ainsi que des exemples de coordination des centres par des ligands exogènes tels que la S-adénosilneméthionine (SAM) dans le cas des protéines de la famille des radical-SAM, le Sirohème dans le cas de la Sulfite Réductase [Error: Reference source not found, Error: Reference source not found]. Ces différences structurales induisent de nouvelles propriétés chimiques qui ont été exploitées par les enzymes, leur permettant ainsi d'avoir de nouvelles fonctions biologiques et catalytiques tels que la régulation de gène, la catalyse non-rédox et rédox , un rôle structural ou un rôle de préassemblage de centre [Fe-S] que l'on décrira dans la partie suivante.

II.1-Les centres [Fe-S] dans le transfert d'électrons

Pendant de nombreuses années, le transfert d'électron fut la seule et unique fonction reconnue des centres fer-soufre. Les réactions de transfert d'électrons sont essentielles dans de nombreux processus biologiques incluant la photosynthèse, la respiration, et la fixation du diazote [Error: Reference source not found]. Les centres [Fe-S] servent de transporteur d'électron(s) soit au sein d'une même protéine, on parle alors de transfert intramoléculaire, soit entre deux ou plusieurs partenaires protéiques, on parle alors de transfert intermoléculaire.

Parmi les protéines [Fe-S] possédant cette fonction on rencontre des protéines contenant des centres [1Fe], [2Fe-2S], [3Fe-4S] et/ou [4Fe-4S] et de centres complexes.

II.2-L'activité enzymatique des centres [Fe-S]

Cette activité assurée par les centres [Fe-S] recouvre un très large éventail de fonctions biologiques qui sont :

- La catalyse non-rédox comme dans le cas des Déshydratases [xviii]. Dans ce cas le centre [Fe-S] est un [4Fe-4S] qui joue le rôle d'un acide de Lewis vis à vis du substrat.

- La régulation de gènes. En effet les centres [Fe-S] jouent un rôle clé pour la fonction de régulation de facteurs de transcription tels que les protéines FNR (Fumarate Nitrate Réductase), IscR, et SoxR d'E. coli. La FNR est un régulateur global qui contrôle l'expression de plus d'une centaine de gènes dans des conditions d'anaérobiose. La forme active, se liant à l'ADN, est un homodimère possèdant un centre [4Fe-4S]2+ par unité. En présence d'O2, il se produit une rapide conversion du centre [4Fe-4S]2+ en un centre [2Fe-2S]2+ qui rend inactive la protéine par perte de la dimérisation. SoxR joue un rôle de senseur dans le cadre du stress oxydant et il a été montré qu'elle réagissait avec le NO. Que ce soit dans le cas de stress lié au superoxyde où à celui lié au NO, la protéine SoxR nécessite la présence d'un centre [2Fe-2S]2+ pour être active. Dans ces conditions, la protéine est capable d'activer la protéine SoxS qui peut alors transcrire l'expression de protéines telle que la Superoxyde Dismutase. On peut aussi citer IscR répresseur de l'opéron isc. En effet, lorsque le pool de centres [Fe-S] dans la cellule et que les protéines [Fe-S] sont actives, IscR possède un centre métallique de type [2Fe-2S]. Sous cette forme, la protéine se lie à l'ADN et inhibe sa propre transcription ainsi que celle de l'opéron isc impliqué dans la biosynthèse des centres [Fe-S]. Pour terminer, on notera l'existence de senseur du fer, la protéine IRP (iron regulatory protein), qui conteniennent un centre [4Fe-4S]. En cas de carence en fer, IRP est dépourvue de son centre métallique et peut alors, sous cette forme d'apoprotéine, activer et/ou inhiber la transcription de certains gènes [Error: Reference source not found,Error: Reference source not found].

- La catalyse rédox au cours de laquelle les centres [Fe-S] jouent un rôle de catalyseur couplé à un processus rédox. Ces types de centres sont représentés par les protéines de la super-famille des radical-SAM particulièrement étudiée au laboratoire, parmi lesquelles on trouve : la Biotine synthase, la Lipoate synthase, la Ribonucléotide Réductuse (RNR) mais aussi la protéine Thiomethyltransférase (MiaB) impliquée dans l'incorporation d'un groupement thiométhyle dans des ARN de transfert [xix]. Toutes ces protéines possèdent un centres [4Fe-4S] typique avec un des atomes de fer différencié, sur lequel vient se fixer la S-adénosylméthionine. Le centre [Fe-S] réduit conduit en combinaison avec la SAM à la formation d’un radical, élément clé de la catalyse, comme dans le cas de la RNR (Figure 5).

(1) [Fe-S] ox + H3CS+RAd  [Fe-S] ox….. H3CS+RAd

e- [Fe-S] red……. H3CS+RAd
(2) [Fe-S] red……. H3CS+RAd  [Fe-S] ox + Méthionine + Ado°
(3) Ado° + glyH  gly° + AdH

H3CSRAd = AdoMet

Ado° = radical 5'-déoxyadénosyle

AdH = 5'-déoxyadénosyle

gly° = radical glycinyle
(1) interaction de AdoMet avec le centre et réduction du centre [Fe-S]

(2) réduction et clivage de Adomet.

(3) génération d'un radical glycil.

Figure 5 : Rôle du centre [4Fe-4S] dans l'activation de la RNR anaérobie d'E. coli

(Fontecave, M., Mulliez, E. & Logan, D. T. in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol 72 95-127 (2002).)

Quoiqu'il en soit de l'état des études en cours sur la compréhension du fonctionnement de tout ces systèmes biologiques impliquant des centres [Fe-S], on comprend bien toute l'importance qu'ils représentent dans le monde du vivant et le rôle fondamental qu'ils peuvent jouer. C'est pourquoi depuis quelques années de nombreuses équipes de recherche, et en particulier notre laboratoire, s'intéressent à une problèmatique en amont, à savoir la biosynthèse des centres [Fe-S]. Il s'agit de comprendre comment les atomes de fer et de soufre sont mobilisés, puis assemblés, et incorporés enfin à la protéine [Fe-S] fonctionnelle. Comme nous le verrons dans la partie suivante de ce chapitre, ce processus implique une machinerie complexe de protéines dont l’une d'elles, la protéine SufA, fait l'objet de l'étude de cette thèse.

III-BIOSYNTHESE DES CENTRES [Fe-S]

III.1-INTRODUCTION

Convaincu du rôle primordial que peuvent jouer les protéines [Fe-S] dans tous les organismes vivants, procaryotes et eucaryotes [Error: Reference source not found], il semblait légitime de s'intéresser au mécanisme de leur biosynthèse au sein de la cellule. Cette énigme a été le fruit d'intenses recherches durant ces dix dernières années, depuis la découverte par D. Dean et ses collaborateurs de protéines essentielles à l'assemblage des centres [Fe-S] de la Nitrogénase d'Azotobacter vinelandii [xx] ; les protéines NifS et NifU. Cette découverte, associée à l'idée généralement admise que ni le fer ni le soufre n'existent sous forme soluble libre dans le cytoplasme, rendait invraisemblable le fait que la synthèse des centres [Fe-S] soit effectuée dans la cellule par simple réaction de l'apoprotéine (protéine sans son centre métallique) avec des atomes de fer et de soufre libres. De toute évidence des systèmes protéiques devaient être impliqués dans le processus de biosynthèse avec comme principales fonctions :

- la mobilisation les atomes de fer et de soufre de leurs sources de stockage respectives.

- l’assemblage sous la forme de centre [Fe-S].

- le transfert à la protéine cible.

et toutes ces réactions devant être parfaitement contrôlées de sorte que ni le fer ni le soufre ne soient libérés durant le processus, ce qui serait toxique pour la cellule.

de fait ces systèmes ont été identifiés. La cellule contient en fait un nombre très limité de "machineries" de biosynthèse pour l'ensemble des différents centres [Fe-S] au nombre de deux essentiellement (SUF et ISC décrit dans les pages suivantes). A la vue de cette stratégie, hautement économique, on peut s'interroger sur la spécificité de ces systèmes. En clair, par quel mécanisme ces "machineries" décident-elles d'assembler tel ou tel type de centre?

Les cellules d'Echerichia coli disposent essentiellement de deux de ces "usines" ou systèmes :

- Découvert en 1998 [xxi], le premier système appelé ISC (Iron Sulfur Cluster) a été largement étudié [Error: Reference source not found,xxii]. Il est à noter l'existence de protéines homologues chez les eucaryotes [xxiii].

- Le deuxième système nommé SUF (SUlFur mobilization), découvert plus récemment, est principalement présent chez les bactéries, même si des homologues ont été récemment découverts chez la plante notamment chez Arabidopsis thaliana [xxiv,xxv,xxvi,xxvii].

Les gènes correspondants, respectivement isc et suf, sont en général organisés en opérons (Figure 6). Alors que les protéines codées à partir de l'opéron isc semblent intervenir dans un processus général pour l'assemblage des centres [Fe-S], celles issues de l'opéron suf joueraient plutôt un rôle dans des conditions de stress [xxviii,xxix,xxx,xxxi].

-

4fhJ
Récemment, un troisième système nommé CSD (Cysteine Sulfinate Desulfinase) a été découvert chez E.coli [xxxii]. Ce système est spécifiquement impliqué dans la maturation du centre [Fe-S] de la quinolinate synthase, une protéine [4Fe-4S] impliquée dans la biosynthèse du NAD [xxxiii]. Ce système est extrêmement simple, comparé aux systèmes ISC et SUF, puisqu'il ne se compose que de deux protéines. Il est possible qu'il fonctionne grâce à la contribution d'autres protéines des systèmes SUF et ISC ou de nature encore inconnue.

Figure 6 : Organisation des opérons ISC, CSD et SUF.

C
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