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I-CONTEXTE BIOLOGIQUE 120




II-MATÉRIELS ET MÉTHODES 123



III-RÉSULTATS ET DISCUSSION 124
IV-PRODUCTION DE SOR MARQUÉE DE T. pallidum 126

IV.1-Production de la protéine SOR marquée 126
V-RÉSULTATS DE PRODUCTION DE LA PROTÉINE SOR 127

V.1-Caractérisation de la SOR de Treponema pallidum 128

V1.1-Caractéristique biochimique 128

V.1.2-Caractéristiques spectroscopiques 129


V.1.2.1-Spectroscopie UV-visible 129

V.1.2.2-Spectroscopie de masse 129
VI-ANALYSE RMN 130

Troisième partie - Matériels et méthodes
Chapitre I : Production de la protéine SOR de T. pallidum 136
I-MATÉRIEL BIOLOGIQUE 136

I.1-souches et plasmides 136

I.2-Milieu de culture 136

I.3-Culture de la souche bactérienne et surexpression de la SOR 136
II-TECHNIQUES DE BIOCHIMIE 137

II.1-Préparation d’extraits cellulaires 137

II.1-Traitement des extraits solubles 137

II.3-Purification des protéines 138

II.3.1-Chromatographie par tamisage moléculaire sur gel ACA 54 138

II.3.2-Chromatographie par résine échangeuse d’anions Uno Q 138
III-ANALYSES BIOCHIMIQUES 138

III.1-Electrophorèse de protéines : SDS-PAGE 138

III.1.1-Préparation des échantillons 139

III.1.2-Conditions de migration et révélation des protéines 139

III.2-Dosage standard 140
Chapitre II : Surexpression et purification de la protéine SufA 141
I-MATÉRIEL BIOLOGIQUE 141

I.1-Clonage du gène SufA et construction du plasmide d’expression 141
II-PRODUCTION ET PURIFICATION DE LA PROTÉINE SufA SIMPLEMENT ET DOUBLEMENT MARQUÉE PAR LES ISOTOPES 15N/13C 142

II.1-Production 142

II.2-Purification 143

II.2.1-Extraction 143

II.2.2-Purification 144

II.3-Reconstitution 144

Chapitre III : Spectroscopie rmn et calcul de structure 145
I-SPECTROSCOPIE RMN 146
II-CALCUL DE STRUCTURE 154
références bibliographiques 156

________________

Comme nous le verrons, les protéines à centre fer-soufre ([Fe-S]) contrôlent un grand nombre de fonctions biologiques. Récemment, un déficit de centre [Fe-S] a été reconnu comme une des caractéristiques biochimiques majeures de pathologies neurodégénératives comme l'ataxie de Friedreich, liée à un défaut d'expression d'une protéine mitochondriale, la frataxine, qui pourrait jouer le rôle de donneur de fer dans la biosynthèse des centres [Fe-S] [1]. Le dysfonctionnement de cette protéine entraînerait un défaut de fabrication de centres [Fe-S] avec pour conséquence l'accumulation de fer dans la mitochondrie. Cette accumulation de fer a pour effet de favoriser le stress oxydant au sein de la cellule. Ce phénomène biochimique, affectant les organismes vivant en aérobiose, trouve son origine dans les imperfections de la chaîne respiratoire au sein de la cellule pour aboutir à la formation d'entités dites espèces activées de l'oxygène (EAO), dotées de propriétés oxydantes parmi lesquelles on trouve l'anion superoxyde O2°-, le peroxyde d'hydrogène H2O2, et le radical hydroxyle OH [2].

Ce phénomène de stress oxydant doit être considéré comme un processus global où les métabolismes du dioxygène et du fer sont étroitement liés. D'une part, la présence de fer libre dans le cytoplasme a pour effet de favoriser la génération du radical OH°, via la réaction de Fenton, et d'autre part les EAO formées sont susceptibles de dégrader les centres [Fe-S], libérant ainsi du fer libre dans la cellule. Dans ce contexte, le laboratoire étudie deux processus biochimiques, le premier étant lié à la détoxification de l'anion superoxyde O2°- par la protéine superoxyde réductase (SOR), le second étant lié à la biosynthèse des centres [Fe-S] contrôlé par différents systèmes protéiques chez E. coli, organisés en opérons. Parmi ces systèmes, on trouve le système SUF (Sulfur mobilisation). Cet opéron, composé de six protéines, est formé de deux complexes protéiques qui seront décrits ultérieurement et d'une protéine particulière, SufA, dont le rôle est de pré-assembler un centre [Fe-S] avant de le transférer à une protéine cible acceptrice. Si on commence à mieux cerner le mécanisme par lequel ces différents systèmes fonctionnent, un certain nombre de questions restent en suspens à ce jour. Il en va ainsi sur la façon dont la protéine SufA préassemble le centre [Fe-S] et le transfère. Pour essayer de le comprendre, il nous a semblé important de déterminer la structure de cette protéine dont aucune n'était connue au début de ce travail de thèse, mis à part la structure cristallographique de la protéine homologue, IscA d'E. coli [3]. Il me semble important de mentionner ici qu’au cours de ce travail de thèse la structure cristallographique de la protéine SufA d’E. coli a été publiée [4] ; cependant, les différences observées, entre cette structure et les résultats préliminaires que nous avions, nous ont encouragé à poursuivre. Cette étude fait l'objet de la première et principale partie de cette thèse alors que la deuxième partie est dédiée à l'étude structurale de la protéine SOR de Treponema pallidum.

La biologie structurale constitue un domaine de recherche performant pour tenter d'élucider les mécanismes fonctionnels des biomolécules qui régissent les organismes. Ainsi les caractérisations structurales et dynamiques à l'échelle atomique des protéines et des acides nucléiques, informent sur leurs fonctions spécifiques. La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est une des principales techniques expérimentales permettant d'apporter de telles informations. Dans le but d'améliorer la compréhension du mode de fonctionnement des protéines SufA et SOR, de structures inconnues au début de nos recherches, nous avons donc entrepris leurs études structurales et dynamiques par RMN. Une brève description de l'approche adoptée, dans cette discipline, pour l'étude de protéine de tailles élevées telle que SufA (2x14 KDa) est exposée dans la première partie.

Chapitre I


Biosynthèse des centres [Fe-S]

INTRODUCTION

Le fer est un élément indispensable à la vie, et sa carence dans un organisme vivant peut occasionner des maladies graves, parfois même létales : l’anémie chez les mammifères, la chlorose ferrique chez les végétaux [i].

Les protéines fer-soufre sont sans doute parmi les premiers catalyseurs que la nature ait utilisés. Il semblerait, en effet, que les conditions extrêmes régnant dans l’atmosphère à cette époque, aient favorisé une chimie du fer et du soufre, d’ailleurs très présents dans la soupe primitive [ii]. Paradoxalement, ces entités ancestrales, et comme nous le verrons fondamentales dans le règne du vivant, n’ont été découvertes que très récemment. C’est en effet seulement à partir des années 1960 que plusieurs résultats expérimentaux tendaient à prouver l’existence de métalloprotéines à fer d’un type tout à fait nouveau [iii]. En 1962, Mortenson et ses collaborateurs isolaient une protéine à fer non héminique de Clostridium pasteurianum, qui s’avère essentielle à la réaction d’oxydation du puryvate [iv]. Les auteurs décidèrent de lui donner le nom de ferrédoxine (Fd), contenant du fer et intervenant dans les réactions d’oxydo-réduction.

Simultanément, une protéine est isolée à partir des chloroplastes d’épinard et, fait troublant, peut être remplacée par la ferrédoxine de Clostridium pasteurianum sans affecter sa fonction initiale [v]. De plus, avec la mise en évidence de soufre labile dans ces protéines [vi], celles-ci deviennent les premiers représentants d’une nouvelle classe de protéines: les protéines fer-soufre ([Fe-S]). Elles se distinguent par la présence d’un site actif constitué par un ou plusieurs atomes de fer liés entre eux par du soufre inorganique, l’ensemble étant le plus souvent lié à la protéine par les atomes de soufre de cystéines.

Les protéines fer-soufre ont aujourd’hui perdu une grande partie de leur mystère et il n’est sans doute pas de classe de métalloprotéines, à l’exception peut-être des protéines héminiques, qui ait fait l’objet d’investigations aussi poussées. Dans ce domaine, l’utilisation conjointe de techniques et d’approches provenant aussi bien de la biologie, de la chimie, que de la spectroscopie physique s’est avérée essentielle. En effet cette démarche a permis d’établir, partiellement du moins, des liens entre la nature du centre [Fe-S] considéré et le rôle physiologique qu’il assure au sein de la protéine. Par contre, la biosynthèse, c'est à dire la manière dont ils sont assemblés in vivo, n’est pas à ce jour complètement élucidée.

Ainsi après une brève présentation des caractéristiques générales des protéines [Fe-S], nous ferons un état des lieux concernant cette biosynthèse en nous appuyant plus particulièrement sur les systèmes étudiés au laboratoire.

I-LES DIFFÉRENTS CENTRES [Fe-S]

Les nombreuses études réalisées sur la famille des protéines fer-soufre ont montré leur importance dans des processus essentiels à la vie, aussi divers que la photosynthèse, la fixation de l’azote, le métabolisme de l’hydrogène ou la respiration cellulaire. Une si grande variété fonctionnelle ne s’accompagne pas, comme nous pourrons le voir ci après, d’une aussi large diversité structurale. Qui plus est, il n'est pas évident d'établir une étroite relation entre ces deux aspects.

I.1-Structure atomique des centres Fe-S

Les centres Fe-S, présents dans les sites actifs de protéines, sont des agrégats polymétalliques composés d’atomes de fer et de soufre agencés en stoechiométrie variable. Ils sont reliés le plus souvent à la chaîne polypeptidique par les atomes de soufre des cystéines, mais aussi parfois par des atomes d'azote d'histidines ou des atomes d'oxygène de sérines ou d'aspartates [vii]. Dans ces édifices, on distingue deux types d’atomes de soufre :

- les atomes labiles, notés S* et appelés "soufre inorganique", qui sont liés uniquement aux atomes de fer.

- les atomes notés simplement S, qualifiés de "thiolates", qui sont liés à l’un des atomes de fer de l’agrégat et qui appartiennent à une cystéine de la chaîne polypeptidique.

On distingue plusieurs types de centre : [1Fe], [2Fe-2S], [3Fe-4S], [4Fe-4S], considérés comme des centres simples, par opposition aux centres complexes qui correspondent à des formes plus exotiques (centres Fe-S associés à d’autres groupes prosthétiques ou à d’autres métaux tels que le nickel, le molybdène ou encore le cuivre).

I.1.1-Les centres [1Fe]

Il est constitué d’un atome de fer central dans une géométrie pseudo-tétraédrique, entouré de quatre atomes de soufre de résidus cystéine de la chaîne protéique (Figure 1) ; ce centre ne correspond pas à proprement parler à la définition d’un centre fer-soufre puisqu’il ne possède pas de soufre labile. On le rattache toutefois à la famille des protéines fer-soufre en raison de sa symétrie et de son environnement exclusivement soufré.

On rencontre ce type de centre dans les protéines de faible masse moléculaire (environ 6 KDa), les rubrédoxines issues principalement de bactéries anaérobies telle que Desulfovibrio vulgaris [viii]. Oxydé, l’atome de fer est ferrique et dans un état haut spin (S=5/2) alors que la réduction en fer ferreux provoque une légère distorsion du centre avec notamment une augmentation des distances Fe-S ; le fer est aussi dans un état haut spin (S=2).




Figure 1 : Représentation schématique d'un centre [1Fe-1S]

centre [1Fe-1S]

type rubrédoxine

Etat rédox

Fe 3+ / Fe 2+

Potentiel redox(a)

+20 à -100 mV

(a) Potentiels rédox donnés par rapport à l'ENH, à pH 7 à 25°C.

I.1.2-Les centres [2Fe-2S]

De nombreuses études structurales de ce type de centre, représentés dans certaines ferrédoxines, ont permis de caractériser les séquences d'acides aminés impliqués dans les sites de liaison. Ainsi, certaines séquences consensus se sont révélées caractéristiques de l'insertion d'un type unique de centre fer-soufre. On distingue en effet quatre catégories de centres [2Fe-2S] :

  • Ferrédoxines de type plante avec une séquence consensus CX4CX2CXNC [ix]. Cette séquence correspond au motif conservé contenant les cystéines supposées ou démontrées comme coordinant le centre [Fe-S]. Elles sont isolées à partir d'organismes photosynthétiques parmi les végétaux supérieurs, les algues, les bactéries.

  • Ferrédoxines de type vertébré (hydroxylase, adrénodoxine) avec une séquence consensus CX5CX2CXNC [x]. Elles sont présentes dans les bactéries non photosynthétiques et chez les mammifères.

  • Ferrédoxines de type Clostridium pasteurianum avec une séquence consensus CX12CX31CX3C [xi].

  • Ferrédoxines de type Rieske avec une séquence consensus de type CXHXNCX2H. Le site actif est lié à la chaîne polypeptidique non pas par quatre cystéines mais par deux cystéines et deux histidines [xii].

Le centre [2Fe-2S], de géométrie plane, est constitué de deux atomes de fer pontés par deux atomes de soufre labiles, et s'oriente perpendiculairement au plan formé par les atomes de soufre des cystéines ou des azotes des histidines pour les protéines de type Rieske (Figure 2). Quelle que soit la nature des ligands, le centre [2Fe-2S] existe dans deux états rédox, oxydé et réduit. Dans l'état oxydé, les atomes de fer sont tous les deux sous formes ferriques, de sorte que la charge portée par le site actif est +2 et le spin total, résultant du couplage antiferromagnétique entre les spins électroniques S=5/2 de chacun des fers, est nul (S=0). En revanche la réduction à un électron conduit à un centre constitué d'un fer ferrique et d'un fer ferreux, qui possède alors une charge résultante égale à +1 et spin total S égal à 1/2.





A = type Ferrédoxine B = type Rieske

Figure 2 : Représentation schématique d'un centre [2Fe-2S]

centre [2Fe-2S]

type Ferrédoxine

type Rieske

Etat d'oxydation

et Spin total

Fe 3+ / Fe 3+ , S=0, diamagnétique

Fe 3+ / Fe 2+ , S=1/2, paramagnétique

Fe 3+ / Fe 3+ , S=0, diamagnétique

Fe 3+ / Fe 2+ , S=1/2, paramagnétique

Potentiel redox(a)

(+2/+1)

+70, -470 mV

-100, +400 mV

(a) Potentiels rédox donnés par rapport à l'ENH, à pH 7 à 25°C.
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