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Boucle cys50

84-86

α1


Figure 6 : vue stéréochimique des 20 structures de plus basses énergies de la protéine SufA sans les parties C-terminal et N-terminal après affinement dans l’eau [résidus 17 à107].
-Analyse du RMSD sur les 20 structures (pour les résidus 17-107)





RMSD (Å)

Chaîne polypeptidique & structure secondaire & atomes lourds

0.60

Chaîne polypeptidique & structure secondaire & tous les atomes

0.61

Toute la structure & structure secondaire & atomes lourds

1.04

Toute la structure & structure secondaire & tous les atomes

1.27

Chaîne polypeptidique & résidus [17-107] & atomes lourds

1.19

Chaîne polypeptidique & résidus [17-107] & tous les atomes

1.23

Toute la structure & résidus [17-107] & atomes lourds

1.52

Toute la structure & résidus [17-107] & tous les atomes

1.70


Les RMSD présentent des valeurs très acceptables. On trouve bien entendu la valeur de RMSD la plus basse pour l’ensemble des structures secondaires en ne considérant que la chaîne polypeptidique et les atomes lourds.


β1

β 6

β 7

β 5

β 4

β 3

β 2

α 1

Cys 50

C-Term

L23

L67

L67

L23

Cys 50

90°


Figure 7 : vue de la structure de plus basse énergie de la protéine SufA sans les parties C-terminal et N-terminal après affinement dans l’eau [résidus 17 à107] sous deux angles.
La qualité de l’ensemble final de la structure RMN de apo-SufA a été analysée àl’aide du programme PROCHECK-NMR. Pratiquement 96% des angles dièdres Φ et ψ de apo-SufA sont situés dans les régions energétiquement favorables du diagramme de Ramachandran. L’énergie expérimentale est faible ce qui suggère une bonne coïncidence avec les contraintes expérimentales. Le résumé des statistiques structurales est donné dans le Tableau 2.




Contraintes expérimentales RMN

nOe intra-résidus non ambiguës 1191

nOe séquentiel non ambiguës 626

nOe médium non ambiguës 208

Total non ambiguës 2025

Total ambiguës 97

Angles dièdres 2x116

Liaisons hydrogènes 54

Couplages dipolaires résiduels 294




r.m.s.d (déviation par rapport aux coordonées moyennes (Å)a,b)

Chaîne polypeptidique & structure secondaire et atomes lourds 0.6

Chaîne polypeptidique & structure secondaire et tousles atomes 0.61

Toute la structure & résidus & atomes lourds 1.52

Toute la structure & résidus & tous les atomes 1.70




Violations de contraintes dans plus de 50 % des structures:

Distance (0.3 Å) 10.75

Dièdres (5°) 7.70

RDC (0.5Hz) 15.85

Liaisons hydrogènes 0




Diagramme du Ramachandran (%)b,c

Résidus dans régions favorables 82.9%

Résidus dans régions autorisées 12%

Résidus dans régions supplémentaires autorisées 3.6%

Résidus dans régions interdites 1.5%




a Statistique sur les résidus [17-107]

b Moyenne des 20 structures de plus faible énergie

c Analyse avec le programme PROCHECK-NMR (les glycines et les prolines ne sont pas prises en considération)




Tableau 2 : Contraintes et statistiques structurales pour le calcul de apo-SufA
Disposant de la structure cristallographique de SufA qui a été publiée entre temps, nous reviendrons sur cet événement, nous avons effectué une superposition des structures de monomère. La superposition a été faite par rapport aux structures secondaires de la protéine SufA sans les parties N-terminal et C-terminal avec l’aide du logiciel MOLMOL et est présentée à la figure 8.



Figure 8: superposition de la structure par RMN de plus basse énergie de SufA en orange avec la structure radiocristallographique (Wada et al (2005) FEBS letters [cxlvi]) en vert (pour les résidus 17-107 de SufA).
On constate aisément que les deux structures monomériques sont similaires. On ne peut rien conclure de probant sur les deux boucles (autour de la cystéine 50 et autour de la glycine 98). En effet nous ne présentons ici qu’une seule structure RMN et nous verrons que la boucle de la cystéine 50 est flexible alors que celle de la glycine 98 est en interaction avec l’autre dimère. On obtient un RMSD de 1.63 Å (Chaîne polypeptidique & résidus [17-107] & tous les atomes) entre ces deux structures. Si les strcutures sont proches, on constate toutefois des différences au niveau de la boucle L67 entre les brins β6 et β 7 ainsi qu’au niveau de la petite hélice α2. Nous savons que la boucle L67 est en fait située à l’interface des deux monomères puisque les résidus qui la constituent présentent des contraintes nOe inter-moléculaires. Il se peut dès lors que le dimère présente une structure légèrement différente entre la forme cristallisée et la forme en solution. Il est plus difficile de conclure quant à la présence de la deuxième hélice. En effet, le manque d’attribution des résidus à ce niveau de la structure pénalise le calcul qui n’arrive pas à converger correctement pour cette zone. Il semblerait donc qu’il y ait bien une boucle même si celle présentée sur la structure cristallographique semble atypique. La principale différence entres les deux structures concerne partie C-terminale où sont localisées les deux cystéines conservées 114 et 116. Wada et al observent dans leur structure dimérique qu’un des segments C-terminal vient se positionner à l’interface des monomères (Figure 9). Le même segment de l’autre monomère n’est pas observé par radiocristallographie. Il en est de même pour la boucle de la cystéine 50 conservée qu’ils observent sur le même monomère que le segment C-terminal visible, alors qu’ils ne voient pas cette boucle sur le second monomère. La partie C-terminale et la boucle de la cystéine 50 de l’unité α2 présentent une densité électronique faible ce qui semble vouloir dire qu’elles sont flexibles tout comme ce qu’on observe par RMN. La flexibilité de la boucle L23 entre les brins β2 et β3, et des segments N-terminal et C-terminal est confirmée par l’étude de dynamique ci-dessous.




Unité α2

Figure 9 : Structure radiocristallographique de SufA d’E coli (Wada et al (2005) FEBS letters

Encerclé en rouge : segment C-terminal

Si on fait un bilan de ce calcul de structure, on peut dire que nous avons atteint notre objectif en ce qui concerne le monomère. La tâche n’a pas été si aisée du fait que nous ne sommes pas en présence d’un monomère mais d’un dimère. La taille de la protéine devient un handicap qu’il est dès lors nécessaire de contourner. C’est ce que nous avons fait en effectuant le double marquage et en enregistrant des expériences qui pouvaient nous donner des informations complémentaires. Nous avons souffert du manque d’attribution qui a induit un taux d’ambiguïté élevé au début des calculs ce qui a fortement perturbé ARIA. En effet, après quelques calculs, le calcul de structure ne convergeait pas et il a été nécessaire d’effectuer une grande partie des attributions manuellement, ce qui représente un coût en temps non négligeable. On est peut-être là devant une des limites des algorithmes actuels qui pour le moment n’ont pas acquis l’expertise humaine. Sans ces codes il nous serait toutefois impossible, de résoudre ce type de structure.

D’autre part dans ce genre de calcul, combinant des informations nOe dont la grande difficulté est le calibrage et des informations orientationnelles issues des couplages dipolaires résiduels, il faut jouer sur le poids respectif des deux types de contraintes à introduire. Il faut pour cela être vigilant, au cours des calculs où sont introduits les deux types de contraintes, aux violations respectives de ces contraintes. Trop de poids mis sur une contrainte peut créer des violations systématiques de l’autre et inversement. Ceci dit, les RDC sont des contraintes locales alors que les nOe sont à la fois des contraintes locales et longues portées. Le conflit risque donc plus entre les nOe courte portée et les RDC qu’entre les nOe longue portée et les RDC. En effet une mauvaise calibration de nOe longue portée affectera peu les RDC. Par contre une mauvaise calibration de nOe courte portée affectera nécessairement les RDC. La conclusion est peut être de donner plus de poids aux nOe dans les premières itérations pour inverser la tendance sur les dernières (en jouant sur les constantes de forces respectives de deux contraintes).
-Conclusion

Comme le montre la représentation en ruban de la figure 7 ; la protéine SufA est repliée en un simple domaine contenant une hélice α formellement identifiée et 7 brins β. Le cœur central de la protéine est constitué de deux feuillets β, un feuillet de 3 brins (B1, B6, B7) et un feuillet de 4 brins (B2, B3, B4, B5) au côté des desquels on trouve l’hélice α1. Deux boucles caractéristiques, une ,nommée L67, entre les brins B6 et B7 (résidus 99-100) et une, nommée L23, entre les brins B2 etB3 (résidus 49-51). Les parties C-terminal (résidus 108-130) et N-terminal (résidus 1-16) ne sont pas structurées. Les cystéines conservées 114 et 116 dans la partie C-terminale sont parfaitement identifiées mais ne sont pas structurées. Le cystéine 50 est située dans la boucle L23 qui présente une flexibilité importante. Les structures caractéristiques B2-L23-B3 et B6-L67-B7 sont stabilisées par des interactions hydrophobes impliquant les résidus Leu20, Val45, Leu57, Phe103 et Phe105 à l’intérieur de la molécule.
V-ANALYSE DE LA DYNAMIQUE DE SufA
Dans le but de compléter la caractérisation du monomère de SufA apo, nous avons étudié la relaxation hétéronucléaire N-H à 600 MHz. Pour l’étude de la dynamique de SufA, nous avons mesuré les trois paramètres de relaxation qui sont la vitesse de relaxation longitudinale R1, la vitesse de relaxation transversale R2 et les paramètres de relaxation nOe.
-Extraction des paramètres de relaxation

Nous avons extrait les valeurs de R1 et R2 à partir de la mesure des intensités de pics de corrélations 1H-15N HSQC enregistrées pour différents délais de relaxation. Les paramètres de relaxation ont pu être mesuré pour 85 % des N-H de la chaîne polypetidique. Les sites qui n’ont pas été considérés sont les prolines ou des résidus dont les pics de corrélation ont des recouvrements spectraux, ce qui induit une imprécision dans la mesure.

La Figure 10 représente le rapport R1/R2 ainsi que les temps de relaxation T1 et T2.

a) b)


Figure 10 :

a) L’analyse du rapport R1/R2 montre que les parties N-terminal et C-terminal sont flexibles et par conséquent pas structurées. La boucle où se situe la cystéine 50 présente aussi une dynamique importante.

b) Les mesures des temps de relaxations T1et T2 montrent de même une flexiblité des partie terminales ainsi que de la boucle de la cystéine 50.

-Commentaire

Du rapport R1/R2 et des mesures de T1 , T2 nous pouvons dire que les segments N-terminal et C-terminal sont flexibles tout comme la cystéine 50 et les résidus qui l’entourent. En effet, ces paramètres intègrent des informations de dynamique qui influencent la relaxation de chacun des noyaux d’un vecteur H-N d’un résidu i.
A ce stade de la thèse nous n’avons pas approfondi ces mesures de relaxation. Ces mesures ont été faite sur le dimère, il nous paraît donc prioritaire de résoudre la structure dimérique de la protéine SufA pour exploiter au mieux les données de relaxation, d’autant plus que SufA n’a pas une forme réellement globulaire comme semble le montrer les premières déterminations de structure sur le dimère.

De ces figures, nous pouvons dire que les parties N-terminal et C-terminal sont flexibles ainsi que la cystéine 50 et les résidus qui l’entourent.


Chapitre IV

Discussion


La protéine SufA présente une structure dimérique d’environ 2x14 kDa avec 130 acides aminés par monomère. La qualité des premiers spectres 1H-15N HSQC obtenus sur SufA apo nous a encouragé à poursuivre cette étude. La stratégie suivie repose sur la préparation d’un échantillon doublement marqué et l’enregistrement de l’ensemble des spectres nécessaires à l’attribution de la protéine. La première étape d’attribution de la chaîne polypeptidique a donné de bons résultats, alors que ceux de l’étape d’attribution des chaînes latérale (64.5% pour le 1H) sont à la limite de ce qui est acceptable en terme d’attribution (score > 75% pour le 1H).Néanmoins ils sont de niveaux suffisants pour envisager un calcul de structure. Cette perte d’information a été un handicap important, particulièrement pour les premiers calculs de structures basses résolutions. En effet, nous souhaitions utiliser toute la potentialité du logiciel ARIA, capable d’effectuer une auto-attribution des contacts nOe, pour réaliser les calculs. Mais ces calculs initiaux n’ont pas permis de converger vers une structure stable. L’importance du nombre d’ambiguïté généré par les atomes non attribués, tout comme les erreurs éventuelles de l’attribution manuelle, n’ont pas permis aux différents calculs de converger. Il a donc été nécessaire d’attribuer manuellement les contacts nOe pour permettre au calcul de replier la structure de la protéine. Bien entendu, ce type d’attribution doit être effectué sans générer d’erreurs (qui risquent alors de fausser le calcul). C’est, en quelque sorte, la stratégie suivie classiquement pour la détermination de structures de macromolécules : attribution de contacts nOe, dont on est sûr, suivie d’un calcul préliminaire (à partir de ces contraintes) avec le programme CNS d’une structure basse résolution, qui servira de modèle dans la suite du calcul sous ARIA. On peut cependant se demander pourquoi, lorsque nous avons utilisé comme modèle la structure de la protéine homologue IscA, le calcul ne convergeait pas mieux. En effet, par ce biais, nous suivions une stratégie classique. Il semble évident que les erreurs d’attributions manuelles ont grandement pénalisées les calculs initiaux, toutefois elles n’ont pas toujours été rejetées au cours des calculs car elles n’étaient pas systématiquement violées. C’est à ce niveau que la perte d’informations structurales, lié au manque d’attribution, était la plus pénalisante. Il semble légitime de penser qu’avec des contraintes supplémentaires, on aurait pu identifier plus facilement les erreurs d’attribution, ou qu’elles auraient été rejetées.

C’est donc seulement après avoir attribué un maximum de contacts nOe manuellement que les premiers calculs ont abouti à une convergence de structure. Le problème est que cette attribution manuelle risque d’introduire de nouvelles erreurs qui peuvent contraindre la structure à se replier dans une mauvaise conformation. Toutefois, les contacts nOe ne sont pas les seules contraintes introduites dans le calcul et par conséquent on devrait observer des violations systématiques de ces autres contraintes lorsque les nOe orientent le calcul vers un mauvais repliement. En minimisant les erreurs, les algorithmes de calcul comme ARIA apportent une aide très précieuse pour les identifier de manière à, soit de les éliminer, soit de les réattribuer.

La détermination de structure est, à l’heure actuelle, un travail en binôme entre la machine et l’utilisateur. Ce dernier garde, bien entendu, la maîtrise d’œuvre de l’étude mais ne pourrait pas résoudre de structure de macromolécule sans algorithme et moyens informatiques puissants. Et ceux-ci progressent régulièrement avec le développement de nouveaux moyens d’expertise de spectres nOe. Ainsi, Hermann et al ont développé un nouveau logiciel, nommé ATNOS-CANDID [cxlvii], capable de gérer les spectres RMN NOESY-HSQC bruts qui ne sont absolument pas attribués. Ce logiciel effectue automatiquement le « peak picking » et l’attribution des contacts nOe suivant une procédure de validation de l’attribution des contacts nOe plus efficace que celle d’ARIA, via un processus nommé « Network Anchoring ».

Cette procédure reste toutefois réservée à des protéines pour lesquelles les spectres sont relativement bien résolus avec un bon rapport signal sur bruit. D’autre part, il est toujours nécessaire d’effectuer l’attribution des atomes de la protéine. Or dans le cas de SufA, c’est à ce niveau que nous avons rencontré le plus de problèmes. Comment ce comporterait ce type d’algorithme sur une protéine comme SufA ? Il serait intéressant de le tester d’autant plus que SufA est un dimère.

En ce qui nous concerne, nous poursuivons le calcul de structure de la protéine SufA sous sa forme dimérique avec ARIA1.2 à partir des contacts intermoléculaires identifiés comme sûrs et d’autres contacts nOe possédant une ambiguïté, intra ou inter moléculaire. Nous avons ensuite fait le choix de partir de la structure monomérique de plus basse énergie comme structure modèle, en adaptant sa topologie au calcul du dimère bien entendu. Surtout nous avons fixé les contraintes de distance de ce monomère modèle. La seule possibilité laissée au calcul est de positionner les deux monomères à partir des contraintes intermoléculaires identifiées comme telles et de gérer les contraintes ambiguës. Bien entendu, toutes les autres contraintes (angles dièdres, liaisons hydrogène, RDC) sont introduites dans le calcul sous ARIA. Nous ne développerons pas plus cette partie à ce stade de la thèse puisque nous venons de commencer les calculs. Une autre stratégie envisageable est d’effectuer une analyse par « docking ». En effet le nombre de contacts nOe intermoléculaires non ambiguës pour la protéine SufA est faible et ils sont localisés uniquement entre les résidus 98-99 d’un monomère (boucle L98) et les résidus 54-55 du brin β3 du second monomère (cf Figure 7 chapitre IV). D’autre part les contraintes ambiguës sont situées au niveau d’un segment 113-116 de la partie C-terminale des deux monomères. Ces contraintes sont toutefois peu nombreuses. L’information structurale est donc faible et par conséquent, le calcul risque de ne pas aboutir au positionnement des monomères. L’utilisation d’un logiciel de « docking » auquel on associe les contraintes nOe expérimentales que nous avons collectées devrait permettre de trouver la solution plus rapidement. En effet il ne s’agit plus de ne recourir qu’aux seules données expérimentales, mais des les introduire comme contraintes ambiguës pilotant le processus de « docking ». Ce processus, utilisé notamment pour la détermination de complexes protéiques par exemple, est basé sur des calculs ab initio. La plupart de ces programmes utilisent la même approche : une molécule est fixée dans l’espace et la seconde est déplacée autour de la première. A chaque nouvelle configuration, un « score » est calculé sur la base de termes tels que l’interaction électrostatique, la répulsion de van der Waals. Mais le calcul doit explorer l’ensemble de l’espace conformationnel disponible. L’idée des créateurs du logiciel « HADDOCK » (High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing) [cxlviii] est de mélanger les deux processus. Ainsi les contraintes expérimentales orientent le calcul ab initio. Cette stratégie devrait, dans notre cas, aboutir plus rapidement à la conformation du dimère.

La détermination de la structure de la protéine sous sa forme dimérique pourrait être une étape essentielle pour comprendre comment est chélaté le centre [Fe-S] au sein de la protéine SufA. En effet il n’a jamais été possible, jusqu’à présent, de déterminer précisément et avec certitude les ligands du centre [Fe-S] que ce soit par des études de mutagénèse dirigée (cf § III.3.3 chapitre I) ou à partir des structures cristallographiques des protéines apo IscA et apo SufA d’E. coli [Error: Reference source not found,Error: Reference source not found]. Toutefois, l’obtention récente de la structure de la protéine homologue IscA de Thermosynechococcus elongatus [cxlix] sous une forme holo a permis de définir ces ligands.
Il existe deux structures de IscA apo d’E coli qui présentent une protéine sous forme de dimère de dimères : dans une des structures, Bilder et al [cl] décrivent deux types d’assemblage de dimères (Figure 1a) alors que dans la seconde structure, Cupp-Vickery et al [Error: Reference source not found] décrivent un seul type d’assemblage (Figure 1b).



Figure 1a : Structure cristallographique de IscA d’E coli (Bilder et al (2004) Biochemistry)[150]

Deux types de tétramère : nommé A à gauche et B à droite


Figure 1b : Structure cristallographique de IscA d’E coli (Cupp-Vickery et al (2004) Journal of molecular biology) [132]

Un seul type de tétramère – en vert Cys35, en jaune Glu98.

Bider et al proposent que le tétramère A soit la forme physiologique présente en solution. Ceci semble confirmé par le second groupe, qui n’observe qu’un tétramère de structure proche de celui du type A de Bilder et al.

Quoiqu’il en soit aucune de ces structures n’a permis d’observer la partie C-terminale où sont positionnées deux des trois cystéines conservées, les cystéines 99 et 101 (équivalentes à 114 et 116 dans SufA) supposées coordinnées le centre [Fe-S].
La structure cristallographique de la SufA sous sa forme apo a été obtenue avec une résolution de 2.7 Å par Wada et al (Figure 3). Cette structure présente, contrairement à la protéine homologue IscA une forme dimérique. La structure monomérique de cette protéine a été présentée dans le chapitre précédent mais nous pouvons rappeler ici que le dimère est constitué de deux monomères positionnés symétriquement. Pour un des monomères, le segment C-terminal comprenant deux des cystéines conservées (cys114 et cys 116) est positionné dans la zone d’interaction des deux monomères. La boucle comprenant la cystéine 50 conservée est observable sur le même monomère. Pour le second monomère aucune de ces régions n’est observée.


Figure 3 : Structure cristallographique de SufA d’E. coli (Wada et al (2005) FEBS letters)
Comme mentionné précédemment la structure de SufA existe, contrairement à IscA, sous forme de dimère. Il est important de noter que s’il n’existe pas de différences fondamentales entre les monomères des deux protéines IscA et SufA, la situation est différente dans le cas des dimères. En effet, les zones d’interactions des diméres pour les deux protéines sont complètement différentes. Si on compare par exemple le dimère α1α2 de la structure de Cupp-Vickery (Figure 4B) à la structure de SufA obtenue par Wada et al (Figure 3), on constate que la zone d’interaction qui implique les résidus du brin A3 et du segment C-terminal ainsi que les contacts entre la boucle L23 et les brins B1, B2 et A3, sont inexistants dans la structure de Cupp-Vickery. Le dimère de SufA présenterait toutefois une ressemblance avec l’unité dimérique α1α2 déduite de la forme tétramérique d’IscA obtenue par Vickery et al (Figure 4D). Mais ce n’est pas la forme retenue pour former le centre [Fe-S] suite à la modélisation. Le dimère C correspond à la seule forme où les sous unités sont assez proches pour former le centre [Fe-S] comme modèlisé par Vickery et al. Mais ce positionnement ne peut exister que dans l’état tétramérique et il ne présente aucune ressemblance avec le dimère de SufA.

On est donc en présence de deux systèmes biologiques proches mais qui ont des états oligomériques différents.



Figure 4 :

A tétramère d’IscA d’E. coli obtenu par Cupp-Vickery [132].

B, C, D dimères déduits de la struture tétramérique d’IscA d’E. coli (Wada et al (2005) FEBS letters) [146]
Dernièrement, la structure de la protéine IscA holo de Thermosynechococcus elongatus, obtenue sous forme native avec son centre [Fe-S], a été résolue par radiocristallographie par Morimoto et al [Error: Reference source not found], avec une résolution de 2.5 Ǻ. Cette structure présente un ensemble formé de deux unités dimériques, chacune contenant un centre [2Fe-2S] positionné à l’interface (Figure 5). Dans cette configuration, le centre [2Fe-2S] est chélaté par la cystéine 103 de la partie C-terminale (cystéine 116 pour SufA) d’un monomère et par les trois cystéines conservées (Cys 35, Cys 101, Cys 103) d’un deuxième monomère mais positionné de manière dissymétrique par rapport au premier. A partir de cette structure et sur la base d’expériences biochimiques de la protéine en solution, Morimoto et al proposent que seule la structure dimérique dissymétrique αβsw avec un centre [2Fe-S] à l’interface, soit la forme active en solution (Figure 6). Toutefois il n’exclue pas le fait que l’autre forme dissymétrique αβ’sw avec un centre [Fe-S] puisse également exister en solution.



Figure 5 :Structure cristallographique de IscA de Thermosynechococcus elongatus

(Morimoto et al., (2006) Journal of molecular biology) [149].



Figure 6 :Modèle proposé de IscA de Thermosynechococcus elongatus chélatant un centre [2Fe-2S]

(Morimoto et al., (2006) Journal of molecular biology) [149].

Sur la base de sa structure, Cupp-Vickery et al proposent quant à eux un modèle de la protéine sous une forme holo avec un centre [2Fe-2S] à l’interface de deux monomères, chaque fer étant coordinné par les deux cystéines C-terminal de chaque chaîne polypeptidique. Dans ce modèle la cystéine conservée, en position 35, (équivalent à la cystéine 50 d’E. coli) n’est pas impliquée (Figure 2). Il est à noter que leur proposition de structure avec le centre [Fe-S] exclue toute possibilité de formation du centre [Fe-S] à l’interface d’un tétramère.


Figure2 : Modèles calculés par Cupp-vickery pour la chélation d’un centre [2Fe-2S]

D’autre part, sur la base de la structure cristallographique de SufA, Wada et al ont modèlisé le site intermoléculaire où le centre [Fe-S] pourrait être postionner. Pour ce faire, ils ont d’abord modèlisé le segment C-terminal manquant, puis en tenant compte de contraintes géométriques (distances Fe-S) intinsèques aux centres [2Fe-2S] et [4Fe-4S], ils ont analysé les distances possibles entre le centre métallique et les résidus potentiellement ligand. Ainsi, ils ont déterminés que les Cys 114 et 116 de chaque segment C-terminal participent à la chélation du centre [Fe-S]. Par contre, ils ne donnent aucune information sur la participation de la troisième cystéine conservée, la Cys 50. Or, nous avons vu, que dans la protéine holo SufA reconstituée, les trois cystéines sont proches du centre métallique. Nous avons donc là une information qui correspondrait plus à celle obtenue par Morimoto et al, mais d’un autre côté notre structure semble très proche de celle de Wada et al.

Tous ces résultats sont, bien entendu, à prendre en considération pour qui s’intéresse à ces systèmes et d’autant plus que les protéines IscA et SufA présentent une grande homologie de séquence et de structures secondaires. Mais ces résultats de cristallographie montrent qu’il existe des différences importantes entre l’état oligomérique de la protéine IscA cristallisée et celui en solution. D’autre part, ces structures de centres [Fe-S] s’appuient toujours sur des modèles calculés ou déduits à l’execption de la structure de T. elongatus. Au final, nous n’avons toujours pas accès à une vision limpide de structures de protéines d’échaffaudage avec son centre [Fe-S]. L’obtention d’une deuxième structure avec un centre [Fe-S] semble donc importante pour valider ou infirmer les résultats obtenus par Marimoto et al.

L’hypothèse forte qui se dégage, globalement, de ces études est qu’une entité dimérique avec un centre [Fe-S] à l’interface représente la forme holo des protéines de type A
La résolution de la structure par RMN sera donc une aide précieuse pour identifier le site de chélation du centre [Fe-S] de SufA. En effet, on pourrait envisager d’effectuer, par exemple, des expériences de RMN paramagnétique sur la protéine holo SufA.

La détermination de la structure de SufA en solution est donc l’étape préalable à cette investigation future. Reste à déterminer la structure de la protéine dimérique. Et ce même s’il existe déjà la structure radiocristallographique de la protéine SufA d’E. coli [Error: Reference source not found]. En effet, comme nous l’avons indiqué sous sa forme apo, l’ensemble de la protéine pourrait être structuré (du moins sous sa forme cristallisée). Mais ce n’est pas ce que l’on observe par RMN avec SufA. En effet, les résultats de dynamique montrent au contraire que les parties N-terminal et C-terminal sont flexibles, tout comme la boucle de la cystéine 50. Par contre, nous observons la même zone d’interaction du dimère. En effet, des contacts nOe intermoléculaires entre le résidu 98 d’un monomère avec le résidu 58 de l’autre monomère de la protéine SufA ont été identifiés avec certitudes. D’autres contacts nOe sembleraient conforter cette zone d’interaction mais il existe encore des ambiguïtés entre intra et inter moléculaire pour ces derniers. Le calcul du dimère prend donc ici toute sa valeur.

Conclusion

On voit bien ici toute la complémentarité que peuvent avoir la RMN et la radiocristallographie. En effet, l’une et l’autre sont susceptibles d’apporter un certain nombre d’informations structurales qui peuvent se confirmer ou se compléter. La RMN donne accès à l’étude de la dynamique de la macromolécule et peut permettre l’étude d’interaction avec des partenaires physiologiques. C’est une technique qui permet l’étude de la protéine d’intérêt en solution donc dans des conditions proches du milieu physiologique.

En ce qui concerne SufA, l’obtention d’une structure ouvre la porte à d’éventuelles études telles que l’identification des ligands du centre [Fe-S]. On peut aussi envisager des études d’interactions de la protéine avec une protéine cible. Cependant ceci nécessite de bénéficier d’un échantillon de protéine reconstituée homogène au niveau de son centre [Fe-S], ce qui est une des principales difficultés de ces systèmes qui par essence sont flexibles et capables de fabriquer différents types de centres [Fe-S] comme décrit dans le chapitre I. Pour conclure nous présentons notre protéine en espérant pouvoir compléter les informations manquantes…



Structure d’un monomère de SufA obtenue par RMN

Seconde partie


La SOR de Treponema pallidum

Le principal objectif de l’étude par RMN de la Superoxyde Réductase (SOR) est la caractérisation structurale de son site actif. En effet, outre l'intérêt que représente la détermination de la structure de ce type de système paramagnétique, on espère aider à la compréhension du mécanisme catalytique par l’analyse RMN de mutants dirigés de la SOR, portant sur des résidus du site actif. D’autre part, ce mécanisme fait intervenir un processus de protonation pour lequel le donneur de proton n’est pas connu. Ainsi des expériences RMN de dépendance en pH devrait nous permettre d’identifier le résidu donneur de proton. Le préalable à ces différentes études étant toutefois d’obtenir la structure de la protéine sauvage. Ce travail a été effectué dans un premier temps en collaboration avec le Docteur Jacques Gaillard du laboratoire SCIB au CEA Grenoble. Cependant, des difficultés, principalement liées à la taille de la protéine et à son état paramagnétique, auxquelles s’ajoute la présence de plusieurs conformations de la protéine, ne nous ont pas permis de mener ce projet à terme.


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